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以Bacmid |
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ATGGCT CCCTTA GGTGAA G3 ;下游引物：5 TCGC GTCGAC TCAACT TTGGCT TAGAAT ATC-3 。上游引物5 端带有EcoRⅠ酶切点，下游引物3 端带有SalⅠ酶切点。采用常规RT-PCR技术获取特异性cDNA。
1.4 PCR产物的克隆及测序 将PCR产物克隆入pCRTM Ⅱ质粒，详细方法见文献［2］。经蓝白筛选、酶切鉴定获得阳性克隆。pCRTM Ⅱ重组质粒及 pYEX4T-1真核表达质粒经EcoRⅠ、SalⅠ双酶切后，将释放出的片段次级克隆入pYEX4T-1真核表达质粒。经酶切鉴定出阳性克隆后，经宝泰克公司自动测序仪进行DNA序列测定。
1.5 重组Bacmid的制备 将pYEX4T-1 载体上人FGF-9 cDNA片段以EcoRⅠ和SalⅠ双酶切位点定向插入pFastBac供体质粒，在DH5α宿主菌内扩增，鉴定出阳性克隆后，将重组pFastBac供体质粒转入DH10Bac细胞，在含有卡那霉素、庆大霉素、四环素及IPTG的培养板上挑选白色菌落，重新划板进行鉴定。然后取阳性的白色菌落培养，裂解，提取重组 Bacmid。0.5%琼脂糖凝胶电泳,23 V 12 h。
1.6 人 FGF-9的表达 在含有10%FCS的TC-100 培养液中培养Sf9细胞。将生长状态良好的细胞移至24孔板，每孔细胞数约为 2.3×105个细胞。室温放置 10 min，待细胞贴壁后，吸去培养液。每孔加入 1 ml溶液B(25 mmol/L Hepes, pH7.1,125 mmol/L CaCl2,140 mmol/L NaCl) 和重组Bacmid 5 μg ,同时以未重组Bacmid (5 μg)和单纯细胞培养为阴性对照。27℃培养4 h后，加入 1 ml含10%FCS的TC-100培养液，在27℃孵箱中培养。根据病毒感染Sf9细胞状况，72 h后收集上清及细胞。离心后，对上清及细胞沉淀按常规方法进行SDS-PAGE。
2 结果
2.1 人FGF-9 cDNA的获取及序列测定 从人新鲜脑胶质瘤组织中以RT-PCR法获得特异性cDNA。扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳鉴定，长度约为647 bp(见图1)。将PCR产物克隆入pCRTM Ⅱ质粒，然后将目的片段次级克隆入pYEX4T-1真核表达质粒。重组pYEX4T-1质粒经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切后，用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆(见图2)。DNA测序的结果表明，扩增的cDNA片段确为人FGF-9全编码区cDNA，编码208个氨基酸（见图3）。
图1 琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物
Fig.1 Analysis of hFGF-9 specific RT-PCR products by agarose gel electrophoresis
Note:lane 1:PCR marker;lane 2:hFGF-9 specific cDNA product
图2 琼脂糖凝胶电泳分析重组pYEX4T-1质粒
Fig.2 Electrophoretic analysis of recombinant plasmid
Note:lane 1:PCR marker;lane 2:PCR product of hFGF-9;lane 3:the pYEX4T-1～hFGF-9 plasmid digested with EcoR I and Sal I
图3 人FGF-9 cDNA测序的部分结果
Fig.3 Part of cDNA sequencing of hFGF-9
2.2 人FGF-9在昆虫细胞（Sf9）中的表达 将人FGF-9 cDNA片段以EcoRⅠ和SalⅠ双酶切位点亚克隆至pFastBac供体质粒（重组质粒具有氨苄抗性），经双酶切及2％琼脂糖凝胶电泳鉴定出阳性克隆。用pFastBac供体质粒转染DH10Bac细胞（感受态细菌抗卡那霉素和四环素），提取重组Bacmid 。将提取物用0.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定,取完整的Bacmid (>135 kb)做PCR鉴定。未插入目的片段的pFastBac供体质粒转座后PCR产物长度是2 300 bp，重组Bacmid 的PCR产物长度为2 924 bp(见图4)。用转座成功的重组Bacmid 转染Sf9细胞，72 h后，收集上清为扩增重组的杆状病毒，用 100 μl收集上一页 [1] [2] [3] 下一页
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