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以Bacmid |
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李慧 魏刚 于永利
摘 要 目的：在Bacmid-杆状病毒-昆虫细胞系统中表达人FGF-9。方法：采用RT-PCR技术，自新鲜人脑胶质瘤组织获取人FGF-9全编码区cDNA，将其克隆入pCRTMⅡ质粒及pYEX4T-1真核表达质粒，经DNA自动测序仪进行DNA序列测定。将人FGF-9 cDNA定向克隆入pFastBac质粒,进一步将其转座入Bacmid中，在昆虫细胞Sf9中进行表达，采用SDS-PAGE对表达产物进行分析。结果：在昆虫细胞表达系统中表达出人FGF-9重组蛋白。结论：人FGF-9在Bacmid-杆状病毒-昆虫细胞系统中得到了表达。
关键词 FGF-9 表达 杆状病毒 昆虫细胞 转座子
中国图书分类号 R392.11
Expression of human fibroblast growth factor-9 in Bacmid-baculovirus
expression system
LI Hui, WEI Gang，YU Yong-Li.
Department of Immunology, Norman Bethune University of Medical Sciences, Changchun 130021
Abstract Objective: To express human fibroblast factor-9(hFGF-9). Methods: The full-length cDNA of hFGF-9 was isolated from human glioma by reverse transcription-PCR. The specific cDNA was cloned into pYEX4T-1 plasmid. The insert was confirmed by DNA sequencing , subcloned into pFastBac donor vector and transposed into Bacmid in DH10Bac. The recombinant Bacmid was used to transform Sf9 cells. The supernatant and cellular lysate were analyzed by using SDS-PAGE. Results: A specific protein in the cellular lysate of Sf9 containing hFGF-9 with MW 30 kD was found. Conclusion: hFGF-9 has been expressed in the Bacmid-baculovirus expression system.
Key words Fibroblast growth factor-9 Expression Baculovirus Insect cells Transposon
杆状病毒-昆虫细胞表达系统是一种真核细胞表达系统。该系统有许多优点：可在进行多种蛋白质的转录后加工修饰，表达水平极高，可达细胞蛋白的50% ；可表达非常大的基因；可同时表达多个外源基因；表达的蛋白质根据其本身的特性在昆虫细胞内外分布。这一表达系统自问世以来，人们对其进行了多方面的改进，使其不断完善。Bacmid-杆状病毒-昆虫细胞系统是一种新型杆状病毒-昆虫细胞表达系统。我们用这一系统进行了人FGF-9表达的尝试。
1 材料与方法
1.1 菌种和质粒 pYEX4T-1购自 CLONTECH Lab-oratories, INC, pFastBac和 DH10Bac购自GIBCO/BRL, pCRTM Ⅱ质粒购自Invitrogen,菌种DH5α、INVaF由本
室保存。
1.2 酶和试剂 Trizol试剂购自GIBCO/BRL,引物经由上海生工合成，TaqDNA聚合酶、纯化质粒DNA所用的试剂盒(Wizard)、DNA回收试剂盒购自Promega公司, 逆转录酶、RNase、T4连接酶及限制性核酸内切酶购自大连宝泰克公司，TC-100购自GIBCO/BRL,新鲜人脑胶质瘤组织来自吉林省肿瘤医院。
1.3 PCR引物的设计及人FGF-9 cDNA片段的扩增 根据已发表的人FGF-9 cDNA序列［1］,我们设计了一对PCR引物,上游引物：5 ACAA GAATTC[1] [2] [3] 下一页
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