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诱导人T细胞对猪抗原免疫耐受的体外实验研究 |
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Key words Immune tolerance T cells Xeno-transplantation
近30年来，随着器官移植学的发展，特别是80年代以来，以CSA为代表的新型免疫抑制剂的出现以及多种单克隆抗体的广泛应用，有效地阻止和治疗了排斥综合症，使得同种异体移植的成功率显著提高［1］，人类移植器官的来源缺乏成为主要矛盾［2］。由于猪的器官与人体器官大小形态相近，来源广泛，器官移植学上属于非协调性容易型移植，因此，选择以猪为供体来源具有极为现实的意义和广泛的应用前景［3］。但是，人对猪的排斥反应更难以控制，由于同时免疫抑制剂降低和破坏了机体正常的免疫防御体系，这些都是器官移植学急待解决的问题。免疫耐受是指针对内源性和外源性抗原特异性的长期免疫反应状态。所以，只有宿主产生对供体的免疫耐受，才是供体移植物长期存活于宿主体内而不被排斥的根本保证［4］。免疫耐受的诱导及其机理的研究是涉及基础理论及临床应用的重大课题。然而，目前所有的诱导方案均因各自的缺陷尚不能用于临床，免疫耐受的机理也远未阐明。本实验拟通过创建新的体外免疫耐受模型和制备异种负调细胞疫苗，采用淋巴细胞定向培养、淋巴细胞增殖实验、淋巴细胞毒性实验、DNA 分析、流式细胞仪检测细胞表面抗原和受体表达、免疫组化等手段，研究幼稚淋巴细胞在此模型中的分化与发育，发育过程中的淋巴细胞对异种负调细胞疫苗初次接触与再次刺激的免疫应答及其细胞凋亡等，探讨负调细胞疫苗诱导幼稚及成熟T细胞免疫耐受的可能性及相应的细胞和分子生物学机制，为寻找符合临床应用条件的有效诱导策略与方法提供理论和实践依据。
1 材料与方法
1.1 材料来源及分组 本实验分别采用健康人清除成熟T细胞的骨髓细胞作为耐受模型中受者免疫系统以及健康人外周血单个核细胞作为外周耐受实验中受者免疫系统。健康成年食用家猪外周血抗原递呈细胞-单核细胞作为异种供体刺激原(以下简称抗原细胞)；将用1%多聚甲醛处理后的猪单核细胞作为耐受原-诱导疫苗(以下简称疫苗细胞-vaccine)［5］。Balb/c 小白鼠外周血的单核细胞作为第3种族来源的抗原。
模型分为3组：对照组(Control)，疫苗诱导组(Group induced by vaccine,GIV)，抗原刺激组(Group stimulated by porcine APC,GSA)。每组重复3个样本。各组经细胞培养15 d左右，检测相关指标。
相关试剂来源：IMDM培养基：美国Gibco公司。胎牛血清：美国Hylone公司。rhIL-3：第三军医大学防原教研室，10×104 U/支。CD2、CD3、CD4、CD8鼠抗人单克隆抗体：北京中山生物技术有限公司产品。新鲜AB型人血清：西南医院血库提供。免疫组化试剂(ABC)：北京中山生物技术有限公司产品。D5637、FITC-CD2、FITC-CD3单克隆抗体：华西医科大学附属一院提供。P-I染液：华西医科大学附属一院提供，50 mg/ml。3H-TdR：中国同位素公司北京原子能研究所，1 mCi/m1。CytoTox96,Non-radioactive Assay 试剂盒：美国Promega公司。CD86(B7-2)单抗：美国Serotec公司。
1.2 实验模型的建立
1.2.1 完全培养液的制备 IMDM，10%胎牛血清，谷氨酰胺，2-巯基乙醇，硫酸庆大霉素，rhIL-3。
1.2.2 人幼稚骨髓单个核细胞的制备 取健康人骨髓单个核细胞，加入CD3单克隆抗体和人补体，清除成熟T细胞后备用。
1.2.3 人外周血单个核细胞的制备 取健康人外周血分离得到单个核细胞备用。
1.2.4 供体抗原及疫苗的制备 取新鲜猪外周血单核细胞作为异种供体细胞抗原。将一部分用1%多聚甲醛固定处理作为诱导疫苗。
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