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脂多糖增强小鼠腹腔巨噬细胞14 2 kD蛋白质磷酸化 |
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orskolin、百日咳毒素、佛波酯(PMA)及蛋白标准品皆购于Sigma;[γ-32P]ATP(1 mCi/ml),北京亚辉生物工程公司;[32P]Pi(10 mCi/ml),北京中国原子能研究所;新生小牛血清(NCS),大连旅顺生物制品厂;RPMI 1640培基,GIBCO公司;多克隆MAPK-2(Mitogen-activated protein kinase-2,也称ERK-2)抗体由加拿大UBC大学Steven Pelech教授赠送;ABC药盒为美国Vector Lab.Inc.;其它试剂均为国产分析纯。 1.1.2 动物 纯系昆明种小白鼠,23~25 g,雌雄不限,本校实验动物室提供。 1.2 方法 1.2.1 Mφ的培养、鉴定及激活[6] 小白鼠腹腔注射4%巯基乙醇(TG)培基,1.5 ml/只,4 d后用含4%NCS的无Ca2+、Mg2+的Hank’s液灌洗,收集小鼠腹腔渗出细胞(PEC)。PEC用RPMI 1640全培基(含20%NCS,4 mmol/L L-谷氨酰胺,4 mmol/L Hepes,0.25%NaHCO3,100 μg/ml青霉素,140 μg/ml链霉素)调成悬液,计数,按5×106细胞/孔分配于6孔塑料培养板中,经贴壁培养得贴壁细胞,后者经Mφ酸性磷酸酶和非特异性酯酶鉴定,98%以上为Mφ。Mφ在受LPS不同时间(15,30,60 min)刺激后或分别用蛋白激酶特异抑制剂、激动剂及百日咳毒素预处理1 h后再受LPS刺激。各种Mφ处理完毕,用PBS洗3遍,然后加入细胞溶解液(0.5%TritonX-100,80 mmol/L β-磷酸甘油,20 mmol/L EGTA,14 mmol/L MgCl2,1 mmol/L Na3VO3,10 mmol/L NaF,1 mmol/L PMSF,pH7.6)溶解细胞,11 000 r/min离心,收集上清,以考马氏亮蓝测定蛋白质含量,然后进行蛋白质磷酸化实验。 1.2.2 Mφ细胞溶解液蛋白质磷酸化 取50 μl细胞溶解液,加入蛋白质磷酸化缓冲液(100 mmol/L Tris-HCl,40 mmol/L MgCl2,3.5 mmol/L ATP)及4~5 μCi [γ-32P]ATP,终体积为65 μl,于37℃保温使磷酸化30 min,然后加入15 μl电泳样品缓冲液,放100℃水浴3 min 终止反应。以13%凝胶浓度进行SDS-PAGE,蛋白上样量为100 μg。电泳完毕,用考马氏亮蓝R250于50℃染色30 min,脱色1 h,观察电泳结果,然后滤纸吸干胶板再进行放射自显影。显影后的胶板可重新染色、脱色,以标准蛋白定蛋白质分子量。 1.2.3 完整Mφ蛋白质磷酸化和Western blot鉴定MAPK-2[5,7] 二者的测定完全按文献进行。
2 结果 2.1 LPS增强Mφ的14.2 kD蛋白质磷酸化 小鼠腹腔Mφ受LPS刺激或先用genistein等试剂预处理后再受LPS刺激,各组Mφ溶解液蛋白质磷酸化结果见图1。从图1中可知,LPS单独处理的Mφ溶解液中14.2 kD的蛋白质磷酸化比对照组显著地增强(Lane 5或Lane 1比较),LPS的这种效应受TPK抑制剂genistein的抑制(Lane 5与Lane 4比较),但不受PKA激动剂forskolin及Gi效应剂百日咳毒素的影响(Lane 5与Lane 2,3比较)。14.2 kD蛋白质密度扫描值与上述结论相一致。
图1 LPS增强Mφ的14.2 kD蛋白质磷酸化 Fig.1 LPS enhanced the phosphorylation of a 14.2 kD protein of Mφ Note: TG-elicited Mφs were treated for 30 min with medium(lane 1) or with 1 μg/ml LPS(lane 5) or (with 1 μg/ml LPS after 1 h of pretreatment with 25 μmol/L of forskolin (lane 2),125 ng/ml pertussis toxin(lane 3),30 μmol/L of genistein (lane 4).The 上一页 [1] [2] [3] 下一页 上一个医学论文: 雷公藤内酯醇诱导人淋巴细胞凋亡的作用与细胞周期的关系 下一个医学论文: 一种新的共刺激信号CD137在人T细胞及其亚群中的表达特点
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