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免疫学技术与方法流式细胞术定量检测细胞凋亡3种方法的比较研究 |
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I 50 mg/ml，0.1%TritonX-100，0.1 mmol/L EDTA(Na)2 ，RNase 50 μg/ml。置黑暗处1 h后检测。
1.2.3 TUNEL法 取2×106 细胞，1%多聚甲醛冰上固定15 min,离心去上清,70%冷乙醇固定24 h。然后按试剂盒说明操作。
1.2.4 Annexin V/PI法 取490 μl细胞加入5 μl FITC-Annexin V及5 μl PI(浓度250 μg/ml)，混匀置冰浴暗处温育10 min，PBS洗2遍，上机分析。
1.2.5 流式细胞仪分析 光源为488 nm氩离子激光器，FITC受激发后发绿色荧光，PI发红色荧光,每份标本收集10 000个细胞,然后在Macintosh650计算机上用相关软件分析数据,用HP-Deskjet 1600CM打印机打印结果。
2 结果
2.1 PI检测法 在正常二倍体细胞DNA峰(G1峰)前出现一亚二倍体凋亡峰,称Ap峰(图1)。
2.2 TUNEL检测法 根据FITC-dUTP掺入量的多少区分正常及凋亡细胞(图2)。
2.3 FITC-Annexin V/PI检测法 正常细胞FITC及PI均低染(FITC- PI- )，在流式细胞分析图上为R1 区细胞簇。凋亡细胞FITC高染而PI低染(FITC+ PI- )，图上显示为R2 区细胞簇。死亡细胞FITC及PI均高染(FITC+ PI+ )，图上显示为R3 区细胞簇(图3)。
图1 PI染色法胸腺细胞FACS测定图
Fig.1 Cytometric diagram of PI staining of mouse thymocytes
图2 TUNEL法胸腺细胞FACS测定图
Fig.2 Flow cytometric diagram of mouse thymocytes using TUNEL assay
Note:A peak.normal cells;B peak.apoptotic cells
图3 Annexin V/PI 双参数法胸腺细胞FACS测定图
Fig.3 Flow cytometric diagram of Annexin V/PI staining of mouse thymocytes
Note:A peak.normal cells;B peak. apoptotic cells+necrotic cells;C peak. normal cells+apoptotic cells;D peak. necrotic cells;R1. normal cells;R2.apoptotic cells;R3. necrotic cells
2.4 PI、Annexin V/PI、TUNEL 3种方法凋亡检出率对照组分别为0、13.12%、1.24%。地塞米松处理组分别为27.19%、32.28%、50.17%,三者之间均有显著差异(P<0.01),Annexin V/PI法死亡检出率13.25%,其凋亡+死亡检出率为45.62%,与TUNEL法凋亡检出率无显著差异(P>0.05)。
2.5 相关分析发现TUNEL法凋亡检出率与Annexin V/PI法凋亡检出率两者相关系数0.63,P<0.05，与Annexin V/PI法凋亡＋死亡检出率二者相关系数为0.7,P<0.05。
3 讨论
近年来有关凋亡信号转导、基因调控等方面的研究已取得重大进展,但作为所有研究基础的凋亡定量检测技术却进展不大。选用何种凋亡检测技术已成为研究的关键。
凋亡定量检测常需借助流式细胞检查。最早出现且较为常用的流式细胞凋亡定量检测技术是PI染色法。细胞凋亡时DNA断裂成小片段，当细胞用乙醇、TrionX-100处理后，这些小片段从细胞内释放出来，使其DNA含量低于正常细胞的二倍体。用DNA结合染料PI染色后分析，可在G1峰前出现一亚二倍体峰即Ap峰。根据Ap峰的百分率可检测凋亡细胞数。在本组研究中PI法凋亡检出率为27.19%,显著低于TUNEL法及Annexin V/PI法。其检出率低的原因主要是凋亡早期尽管有DNA裂点形成，但尚未出现DNA片段的大量丢失，因此该法不上一页 [1] [2] [3] 下一页
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