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磷脂抗体阳性红斑狼疮患者周围血T细胞受体基因表达初探 |
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s with active SLE and controls in TCR Vβ/Cα(P＜0.05～0.01). Conclusion: Dominont expression of selective TCR-Vβ would play an important role in pathogenesis and disease activation of SLE.
Key words TCR-Vβ SLE APL HLA-DRB1 DQA1
系统性红斑狼疮(SLE)是累及多系统的典型自身免疫病之一。其发病机理至今不清。患者血清中诸多自身抗体的产生，T细胞所参与的免疫应答是机体整个免疫调节的核心。近来不断有用T细胞受体(TCR)谱研究自身免疫性疾病报道，如多发性硬化症(MS)［1］，自身免疫脑脊髓膜炎(EAE)［2，3］，自身免疫性甲状腺炎［4］，重症肌无力(MG)［5］等。在这些自身免疫病中，其TCR特定成分的有限性取用有明显的偏移。但对SLE患者的T细胞受体谱的研究甚少。免疫应答三分子复合体即“抗原-T细胞-MHC”，T细胞受体的行为严格受主要组织相溶性复合体(MHC)II类抗原的限制。本文选择具有阳性抗磷脂抗体，HLA-DRB1*0803/DQA1*0103的系统性红斑狼疮患者，探索其TCRβ基因可变区(TCR-Vβ)是否存在偏移。
1 材料与方法
1.1 病例 本院风湿病科患者和正常对照，均为HLA-DRB1*0803/DQA1*0103。其中SLE患者4例，活动期SLE 3例(2例女性，1例男性)，非活动期SLE 1例(女性)，平均年龄42.05±10.4岁。病人对照1例，为干燥综合征(SS)，女性30岁。正常对照3例，均为女性，平均年龄48.30±12.6岁。
1.2 实验方法
1.2.1 周围血淋巴细胞的收集 取静脉血10 ml肝素抗凝，密度梯度离心法分离单个核细胞。
1.2.2 总RNA的抽提 应用QIAGEN RNeasy Total RNA kit。
1.2.3 逆转录cDNA 应用CLONTECH 1st-strand cDNA synthesis kit。
1.2.4 荧光标记引物，PCR扩增TCR-Vβ家族基因 5′端 Vβ引物: 应用CLONTECH T cell Receptor Typing Amplimer kits。 Vβ1～Vβ25，5′-Cα为内参照引物；3′端引物: 6-FAM 荧光标记引物3′-Cβ，3′-Cα的合成，6-FAM 购自ABI公司，荧光标记引物由中科院细胞所合成。PCR扩增: PCR反应仪, PE公司DNA Thermal cycler 480。
PCR条件：5′-Vβ，3′-Vβ，5′-Cα，3′-Cα均1 μl (25 μmol/L);cDNA 2.5～4.0 μl(RNA浓度为0.100～0.272 μg/ml);10×PCR缓冲液2.5 ml，MgCl2 2 μl(25 mmol/L); dNTPmix 1 μl(10 mmol/L GILBCO 公司); Taq 酶 0.5 μl ( Promega Taq DNA polymarase， 5 U/μl)加DEPC处理的蒸馏水到总反应体积25 μl，小心加入20 μl石腊油,于薄壁管(Gene Amp),95℃，1 min,55℃ ，1 min，72℃，1 min，32个循环，最后72℃ 延伸7 min，PCR产物避光置4℃保存。
1.2.5 琼脂糖凝胶电泳初步鉴定PCR产物 1.5%琼脂糖凝胶，0.5 μg/ml溴乙锭，0.5×TBE 缓冲液，电泳30 min，用紫外光凝胶图像分析仪(UVP公司)初步鉴定PCR产物Vβ和Cα。
1.2.6 373 DNA SEQUENCER GENE SCAN荧光标记定量PCR方法分析Vβ家族基因 凝胶制备: 6%聚丙烯酰胺凝胶，1×TBE缓冲液(GILBCO BRL)。电泳: Vβ1/Cα～Vβ25/上一页 [1] [2] [3] 下一页
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