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神经肽Y |
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董永光 薛永涛 张 旭 鞠 躬
(第四军医大学神经科学研究所神经生物研究室，西安 710032)
摘要 为探明神经肽Y(NPY)受体在中枢神经系统的分布，用免疫组织化学方法，研究了NPY-Y1受体亚型免疫反应神经细胞及纤维在大鼠中枢神经系统的分布。结果表明，NPY-Y1受体免疫反应神经细胞或/和纤维在嗅结节、海马、屏状核、背侧丘脑诸核群、下丘脑弓状核、三叉神经感觉主觉和脊束核等结构中分布密集，在额叶、颞叶、前嗅核、杏仁核等部位中也有较丰富的分布。提示NPY-Y1受体与嗅觉、躯体感觉和下丘脑的某些功能有着密切关系。
关键词 神经肽Y 受体 免疫组织化学 大鼠
神经肽Y(NPY)，为含36氨基酸的多肽，属胰多肽家族［1］。它是中枢神经系统中分布最广泛的肽类神经递质之一［2，3］，参与血管收缩、摄食、激素分泌以及情绪等生理功能的调节［4，5］。目前已被克隆的NPY受体有Y1、Y2、Y3、Y4和Y5受体亚型，均属G蛋白相关联受体超家族［6］，对这些受体的克隆使制备其抗体成为可能。为进一步明确NPY-Y1受体在中枢神经系统的分布，我们制备了抗NPY-Y1受体C末端多肽片段，对NPY-Y1受体在大鼠中枢神经系统中的分布进行了研究。
材料和方法
1.免疫组织化学
用成年雄性SD大鼠10只(第四军医大学动物中心提供)，体重200～250g，戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(50mg/kg)，先经心脏灌注37℃生理盐水50ml和温固定液50ml，固定液用0.1mol/L磷酸缓冲液(PB)配制，其中含4%多聚甲醛，再灌不4℃同样固定液250～300ml后，取脑，置入同样固定液中后固定2h，浸入20%的蔗糖PB溶液中24h，然后做冠状冰冻连续切片，片厚50μm，每3张切片取1张，置入抗NPY-Y1受体的兔血清［7］，工作浓度为1∶15 000～20 000，4℃冰箱中孵育48h，用抗生物素-生物素-过氧化物酶复合物技术(Vector ABC kit)进行免疫反应，再用葡萄糖氧化酶、二甲基联苯胺、硫酸镍铵加强法显色［8］，依关后顺序将脑切片贴于载玻片上，干燥，透明，DPX封片，显微镜观察摄片。
免疫组织化学吸收试验：将制备抗体用NPY-Y1受体的合成多肽片段(10-6mol/L)加入工作浓度的抗NPY-Y1受体兔血清中，4℃冰箱孵育24h，将以上脑片和腰段脊髓切片的相邻切片置入孵育，然后做ABC法。
2.蛋白印迹法
取SD大鼠皮质、海马、下丘脑及腰段脊髓在匀浆缓冲液中(20mol/L PBS,pH7.2；1.0mmol/L PMSF,2mmol/L EDTA)用高速分散器(每克组织加10ml匀浆缓冲液)匀浆，加入triton X-100至终浓度为1.%%，冰浴30min，15 000g离心20min，取上清液，将上清液样品加入等体积缓冲液(10mmTris-Cl pH7.2；20mmol/L DTT,4%SDS,0.2%溴酚蓝，20%甘油)，100℃孵育5min后，取50～100μg蛋白进行10% SDS-聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)分离蛋白，电泳后转移至硝酸纤维素(NC)膜(Schleicher and Schuell公司)，NC膜用1%BSA封闭1h后，在稀释度为1∶3 000抗NPY-Y1受体的抗体中孵育1h，用含0.05%tween-200的PBS洗涤［9］，ABC法处理。
结 果
1.免疫组织化学
NPY-Y1受体免疫反应神经细胞胞体和神经纤维可见强度不一的蓝黑色着色，将大鼠脑中核团或区域中NPY-Y1受体免疫反应细胞和纤维的标记强度粗略分为+++(强)，++(中)，+(弱)3个等级，详见附表。
附表 神经肽Y-Y1受体免疫反应阳性结构在大鼠脑内分布
Table The distribution of NPY-Y1 receptor immunoreactive structures in the rat brain
区域
brain region 阳性细胞
neuron 阳性纤维
terminals 区域
brain region 阳性细胞
neuron 阳性纤维
terminals
嗅脑
Rhinencephalon CA3
CA3 + +
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