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大鼠三叉神经节及尾侧亚核内降钙素基因相关肽在面口部伤害性刺激时的动态变化 |
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.2%牛血清白蛋白、0.2%菲可400、0.2%PVP K－30)］，15 μl DTT及标记探针(6～9×106DPM)滴加到切片表面，40℃孵育48h。杂交后，用1×SSC冲洗，最后将Amersham LM－1型乳胶涂在切片表面，置暗盒中曝光(4℃)。4周后，进行显影、定影，经1%硫堇复染，脱水、透明、封片，光镜下明、暗视野观察。
2.4 竞争性对照实验：取部分切片经常规杂交前处理后，用既含标记探针又含100倍于标记探针的未标记探记的杂交液孵育，其余过程相同。结果未发现阳性神经元。
3.免疫组织化学法
各组大鼠达到规定时间(对照组存活1h)后，戊巴比妥钠深麻，开胸经左心室插管至升主动脉进行灌注，先用100 ml生理盐水冲净血液，再用含4%多聚甲醛的0.1 mol/L PB(pH7.4)500 ml灌注固定。取脑及TG，置于上述固定液中后固定4h(4℃)，再移入含30%的蔗糖的0.1 mol/L PB中过夜(4℃)。冠状及水平冻切，片厚30 μm，切片分成3组收集，第1组行CGRP免疫组织化学反应，第2组作Nissl染色。切片分别入：(1)兔抗CGRP血清(1∶1000，INCSTAR)，室温孵育18～24h；(2)Biotin结合的羊抗兔IgG(1∶200，Vector)，室温孵育2～4h；(3)Avidin结合的HRP复合物(1∶100，Vector)，室温孵育1～2h。最后行DAB呈色反应。上述各步骤间均用PBS彻底漂洗。切片裱于涂有明胶的载玻片上，脱水、透明、封片，Olympus显微镜观察并摄片。
以正常羊血清代替兔抗CGRP血清孵育第3组切片，结果为阴性。
4.结果统计及图像分析
4.1 CGRP mRNAs在TG内的表达变化：各时间点的每只大鼠均随机选取12张切片，刺激侧及对侧各6张，在明视野计数阳性神经元的数量。阳性神经元胞浆表面银颗粒密度应高于背底5倍以上(即信/噪比>5)。
4.2 CGRP－LI在Vc浅层和TG内的变化：各时间点的每只动物均选取Vc和TG的各10张切片，用Leica Q－500图像分析仪对Vc浅层内CGRP－LI的密度进行测定，并对TG内CGRP阳性神经元计数。
对上述各组数据进行配对t检验，分别判断实验组与对照组之间和刺激侧和对侧之间TG内CGRP mRNAs的表达，Vc内CGRP－LI的密度和TG内CGRP阳性神经元的数量是否存在差异。
结 果
1.原位杂交法结果
明视野下观察，TG内有许多神经元被α－CGRP和β－CGRP探针标记(图1A，B)。在对照组，约37.4±0.8%和22.3±0.5%的神经元呈α－CGRP和β－CGRP mRNAs阳性。在Vc未见到两种亚型mRNA的杂交信号。
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