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p21Cip1基因对V79 |
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江 虹 冯 洁 王永潮
(北京师范大学生物学系细胞增殖及调控生物学开放实验室，北京 100875)
摘 要 为了探讨缺乏可测出G1、G2期V79-8细胞株的细胞周期失调的分子机理，构建了人的周期负调控基因p21Cip1的可表达重组质粒pXJSC，转染该细胞系，建立了高表达p21的V79-8-SC细胞。以3HTdR放射自显影法，流式细胞光度术，细胞增殖曲线测定及免疫印迹技术，检测及比较了与细胞周期变化和增殖有关基因的表达，发现该细胞较对照细胞V79－8－neoG1期明显延长，G2期也稍有增加。与此同时，G1期调控的cyclinD1、CDK4、Id基因表达明显下降，G2期调控基因cyclinB1的表达也有所下降。结果表明：此细胞系的细胞周期缺陷可能由于p21Cip1、CDKs/cyclins及其相关基因的表达失调所致。
关键词 V79-8细胞 p21Cip1基因 细胞周期调控 转染
V79-8是一种增殖速度非常快的中国仓鼠肺成纤维细胞系(Chinese hamster lung fibroblast)，它的倍增时间仅为9.5～10h［1,2］。该细胞由Elkind和Sutton于1960年从其母细胞系V79转化而来，V79最初由Ford和Yerganian于1958年建系。1967年,Robbins和Scherff用［3H］胸腺嘧啶核苷参入法(［3H］thymidine incorporation assay)首次发现V79-8细胞缺乏可检测的G1期，1977年Liskay［1］用同样的方法证实V79和V79-8也缺乏可检测的G2期。V79-8具有非常短的G1、G2期这一特性，为研究高等真核细胞G1期、G1/S、G2/M转换的调控提供了很好的模型。
通过Northern杂交检测，我们曾发现V79-8细胞中cyclinD1、cyclinD3及Id mRNA的表达明显高于V79细胞(待发表)，由此推测这些G1期调控因子的高表达可能造成了V79-8细胞G1期的缺失，所以如果人为地改变G1期调控因子的表达，就有可能使V79-8细胞的G1期明显延长，从而可在体内研究它们对细胞周期造成的影响。此外，我们的结果显示，V79-8细胞中p21与人和小鼠不同，有两个转录本。
材料和方法
1.细胞培养
V79-8细胞由美国MD Anderson肿瘤中心PN Rao教授赠送，培养于DMEM(GIBCOL BRL)培养基(10%小牛血清，108IU/L青霉素，100mg/L链霉素)，37℃，5%CO2的孵育箱中。
2.G418剂量预实验
处于对数生长期的V79-8细胞以3×103细胞/cm2接种，培养过夜，待细胞完全贴壁后，分别以含G418(GIBCOL BRL)100、200、400、600、800mg/L的新鲜培养基换液，平行3组对照，每3d换1次液，换3次(9d)后，选择G418致死细胞的最小浓度。由此测得G418筛选V79-8细胞的药物浓度为400mg/L。
3.真核表达p21Cip1重组质粒的构建及V79-8-SC细胞株的建立
用限制性内切酶XhoI/KpnI将p21 cDNA从p21-pGEX-2TKcs质粒上切下，正向克隆至真核表达载体pXJ41-neo的多克隆位点处。
构建的重组质粒pXJSC用磷酸钙法转染V79-8细胞(转染时细胞汇合度约为30%)。48h后细胞培养于含400mg/L G418的培养液中筛选阳性细胞，2～3d换液1次，细胞长满可传代继续筛选。10d之后，细胞以10个/cm3接种，长成肉眼可见的集落，分别挑入24孔板中，长满后转入大方瓶培养，转染的细胞始终以400mg/L的培养基保种。以Northern杂交及免疫印迹鉴定阳性细胞中p21的表达。
同时，pXJ41-neo空载体转染细胞以建立对照细胞株V79-8-neo。
4.Northern杂交
细胞总RNA用异硫氰酸胍一步法提取，上样量为15μg，1%甲醛变性凝胶电泳后，真空转移至尼龙膜上，杂交探针为自制的体外转录［α-32P］rUTP标记单链反义RNA，探针来源、RNA聚合酶及转录本长度如下：pXJ41-p21Cip1(antisense)-T7-1kb; pGEM3z-β-actin-sp6-0.5kb; pSK-CDK4-T3-1.3kb; pGEM4z-CycD1-sp6-1.14[1] [2] 下一页
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