|
RB基因在小鼠生殖细胞发生过程中的表达研究 |
| |
nit，消毒三蒸水调总体积为20μl，37℃保温16h，然后加0.2mol/L的EDTA 2μl、4mol/L的LiCl 2μl终止反应。0.5倍体积预冷的无水乙醇，置20℃过夜沉淀DNA，12 000r/min，离心20min，沉淀用50μl l×TE溶解。这样制备后的地高辛标记探针其浓度为5mg/L。
2.4 组织原位杂交：无论睾丸或卵巢，每实验组均分别随机取5张切片用于原位杂交。具体杂交方法按文献［4］并稍加修改进行。
2.4.1 预处理：石蜡切片经二甲苯脱蜡20min，用无水乙醇洗2次，置换二甲苯(10min×2)，置空气中干燥，2×SSC饱和20min。
2.4.2 预杂交：用消毒滤纸擦干玻片上组织周围的水分，但保持组织湿润。玻片置于4×SSC饱和的湿盒中，组织材料上加20～30μl预杂交液，42℃过夜。
2.4.3 杂交：在预杂交液中加入适量的变性标记探针，浓度为50μg/L，每张玻片组织切片上滴加20～40μl，42℃温盒过夜。同时检测4个组(睾丸2个组、卵巢2个组)。
2.4.4 免疫显色：将杂交后的玻片置2×SSC中洗1h，1×SSC中洗1h，0.5×SSC 37℃洗30min，封闭剂〔(30%牛血清白蛋白，0.3%TritonX-100)，buffer1稀释(buffer1∶100mmol/L Tris-HCl,150mmol/L NaCl,pH7.5〕中室温孵育2h，以消除非特异性抗原。复合抗体(Dig)-AP, 1∶500 buffer1稀释，室温孵育过夜。buffer1洗2次，每次15min，NBT显色液暗盒显色6h。EDTA终止反应。乙醇系列脱水，二甲苯透明，树胶封片。
2.4.5 对照组织实验： 用标记直链PBR322作阴性对照，实验操作与RB基因探针相同并同时进行。
结 果
1.RB基因探针与睾丸组织的杂交结果
1.1 未成熟组(5周龄)(图1)：用RB探针检测该组切片，多数曲细精管中杂交信号强烈，并且显示这种杂交信号的细胞是离开基底膜第2层或第3层以内直至从内层倒数第2层细胞的胞质，其核未被标记(没有杂交信号)。在个别曲细精管中甚至无任何细胞被标记。在有杂交信号的曲细精管中，因杂交信号无法反映细胞的分化状态而无法比较不同时期细胞的信号变化规律，但从信号在细胞层的分布判断，杂交信号主要在初级精母细胞、次级精母细胞中，而外周精原细胞和最内层的精子细胞以及整个曲细精管的固有膜，整个睾丸间质区，均无明显杂交信号。
上一页 [1] [2]
上一个医学论文： gp130分子在树突状细胞上表达及其意义
下一个医学论文： p21Cip1基因对V79
|
|
|
|
|
|
|
您现在的位置： 绿色健康网 >> 医学论文 >> 基础医学论文 >> 正文