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CD3 胞浆区Tyr突变阻断下游的细胞凋亡信号传递 |
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CD3ε和CD3ζ两个亚单位传递的，CD3ε和CD3ζ胞浆区含有保守的免疫受体酪氨酸激活基序(immune receptor tyrosine-based activation motif，即YXXL(X)YXXL/I7-8，简称为ITAM)，TCR/CD3的刺激信号使ITAM中的酪氨酸快速磷酸化，其下游的蛋白酪氨酸激酶（PTKs），如ZAP-70、Lck和Fyn等与酪氨酸结合而活化，从而诱导一系列胞内生化事件，如相关蛋白的磷酸化、胞浆Ca2+浓度升高、Ras-GTP积累、转录因子活化等，最终激活一系列基因表达，使T细胞激活［1］。
本实验室以往的研究中，构建了CD8α胞外区、跨膜区和CD3ε胞浆区（含ITAM）的融合基因（CD8ε），并转染CD8阴性的Jurkat细胞，经G-418筛选获得了稳定表达CD8ε的细胞株（命名为T-JK），用抗CD8单抗刺激能诱导T-JK细胞凋亡［2］。将此融合基因胞浆区ITAM中两个酪氨酸分别突变或同时突变为苯丙氨酸的CD8ε（Y170F）、CD8ε（Y181F）和CD8ε（Y170F/Y181F）分别转染Jurkat T细胞，获得稳定表达的各细胞株分别命名为T1-JK、T2-JK和T3-JK。在同样条件下，抗CD8单抗刺激不能引起T1-JK、T2-JK和T3-JK细胞凋亡［2，3］。此结果表明CD3εITAM中的两个酪氨酸不仅在介导细胞激活中，而且在介导细胞凋亡中均起必不可少的作用。但CD3ε介导的T细胞凋亡的信号传递途径仍不明了，本文进一步探讨了CD3εITAM中两个酪氨酸位点的突变对下游细胞凋亡信号的影响。
1 材料与方法
1.1 蛋白酪氨酸磷酸化的检测 本实验室已经构建的野生型CD8ε、突变型CD8ε（Y170F）、CD8ε（Y181F）和CD8ε（Y170F/Y181F）融合基因转染CD8-Jurkat细胞后，所获得的4株稳定表达上述融合蛋白的细胞株分别命名为T-JK、T1-JK、T2-JK和T3-JK［3］。取1×106细胞，用PBS洗1次，离心弃上清，细胞悬浮于100 μl含20 μg/ml抗CD8单抗并已预热至37℃的PBS中，细胞刺激3 min后，加入1 ml预冷的PBS终止刺激。同时设不经抗体刺激的阴性对照。离心收集细胞，按常规方法裂解细胞，总蛋白经SDS-PAGE电泳分离，转印至NC膜，用抗磷酸化酪氨酸（PTyr）单抗（PY20）进行Western蛋白免疫印迹，用碱性磷酸酶显色系统(B.M公司）显色。
1.2 胞浆Ca2+浓度的检测 1×106细胞用Hank s平衡盐水（HBSS）洗2次，再将细胞悬浮于1 ml HBSS，加入5 μl Ca2+探针Fluo-3/AM（Molecular Probes公司，1 mmol溶于DMSO），使终浓度为5 μmol/L，于37℃保温30～60 min。HBSS洗1次，细胞再悬浮于HBSS中。先不加抗体，以流式细胞仪分析胞浆Ca2+浓度。然后加入含抗CD8单抗的PBS（抗体终浓度为20 μg/ml），刺激细胞1 min，立即用流式细胞仪分析Ca2+浓度的变化。
1.3 nur77基因表达的检测 将5×106各转染细胞不经抗体刺激或于150 μg/ml抗CD8单抗包被过的培养皿中刺激1、2和4 h后，离心收集细胞并提取总RNA，进行甲醛凝胶电泳后，按常规方法转至NC膜。以nur77 cDNA片段为模板，随机引物法标记探针。65℃预杂交液(0.25 mol Na2HPO4,pH7.4,7%SDS)中杂交30 min，加入标记好的探针杂交过夜。然后按常规进行洗膜，X光片曝光，洗片和观察杂交结果。
1.4 fas基因表达的检测 5×106转染细胞不经抗体刺激或于150 μg/ml抗CD8单抗包被过的培养皿中刺激4 h，离心收集细胞，用一步法提取总RNA。按下述方法进行RT-PCR反应：总RNA 3 μg（8 μl）,Oligo（dT）2.5 μl和ddH2O 4.0 μl，混匀，离心，于95℃加热2～3 min后取出，缓慢冷却至室温。加入1.0 μl RNasin（50单位）、2.5 μl 10×逆转录反应缓冲液、2.5 μl 10×上一页 [1] [2] [3] 下一页
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