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人可溶性IL |
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0结合能力的决定性因素之一，但基本不影响其与 IL-6 的结合能力［2，3］。在本文中，我们首先克隆了天然人sIL-6R基因，并进而将第280位的His突变成Ile，即同时改变氨基酸的电荷性质及大小，将二者同时在COS7细胞中表达后，分析它们的生物学性质，为进一步研究sIL-6R空间构效关系打下了基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 酶和试剂 所用工具酶分别购自Promega公司、Gibco公司。LIPOFECTIN\,DMEM\,1640为Gibco公司产品。DNA序列分析试剂盒为USB公司产品。“DNA 体外突变系统”(Alters Sites II in vitro Mutagenesis System)为Promega公司产品。sIL-6R抗血清为本室自制。Bio-SAR-IgG、Avidin-HRP购自华美公司。
1.1.2 质粒、菌种 携带有人IL-6R cDNA的质粒由日本大阪大学Hirano教授惠赠。克隆质粒pALTER-1、菌种JM109由“DNA体外突变系统”提供。表达质粒pSVL、pCMV4为本室保存。
1.1.3 细胞株 COS7细胞用含10%FCS的DMEM培养基传代培养；7TD1为IL-6依赖的小鼠杂交瘤细胞系，用含10%FCS，5×10-5mol/L 2-ME的1640培养基传代培养，并添加2 ng/ml的IL-6；R2细胞为LT12细胞(大鼠急性髓系白血病细胞系)转染了人IL-6R基因后建立的细胞系［4］，对IL-6的反应为生长抑制性，用含10%FCS的1640培养基传代培养。以上细胞系均由本室保存。
1.2 方法
1.2.1 DNA重组技术 参照文献［5］。
1.2.2 DNA序列分析 采用USB公司Sequence Version 2.0 DNA Sequence Kit，并按其说明书进行。
1.2.3 DNA定点突变 按Promega公司“DNA体外突变系统”说明书进行并略加改动。
1.2.4 脂质体介导DNA转染COS7细胞 按Gibco公司的LIPOFECTIN使用说明书进行。
1.2.5 sIL-6R的ELISA检测及定量 用梯度稀释的标准 sIL-6R(每孔100 μl)包被酶联板，4℃过夜，经1%BSA 37℃封闭2 h后，依次加入sIL-6R抗血清、Biotin标记的SAR-IgG和Avidin-HRP,OPD显色10～15 min，1 mol/L H2SO4终止反应。表达上清50 μl与等体积包被液混匀后包被酶联板进行检测。
1.2.6 Western blot检测 转染细胞上清于20% PEG溶液中，浓缩4～5 h(约15倍)后，取20 μl走SDS-PAGE电泳，经转印、封闭、抗体结合等步骤后显色。
1.2.7 Binding assay ELISA法检测sIL-6R与IL-6的结合能力 用IL-6(10 μg/ml)包被酶联板(每孔100 μl)，经1%BSA 37℃封闭2 h后，加入梯度稀释的标准sIL-6R，于37℃作用3 h或4℃过夜，再加入sIL-6R抗血清和HRP-SAR-IgG，分别于37℃作用1 h，OPD显色，1 mol/L H2SO4终止反应。sIL-6R及突变体基因转染的COS7细胞培养上清经ELISA定量后，以等量水平加入酶联板，稀释液采用无血清DMEM培养基。
1.2.8 sIL-6R的生物学活性测定 7TD1细胞：参考文献［6］，测试前，用无血清1640培养基洗3次，37℃ 5%CO2孵箱中饥饿1～2 h后，以5×104 ml-1的浓度悬浮并接种入96孔板中(每孔100 μl)，每孔加入不同浓度IL-6及等量的天然sIL-6R或其突变体表达上清，按终体积为200 μl在每孔中补加适当体积的10%FCS-140，72 h后加入MTT(5 mg/ml，每孔15 μl)，继续孵育5 h，用10%酸性SDS溶解沉淀过夜，并于570 nm处测定光密度值。R2细胞：细胞按1×105 ml-1接种入96孔板中(每孔100 μl)，每孔加入不同浓度的IL-6及等量的天然sIL-6R或其突变体表达上清，48 h后加入MTT，以下步骤同上。
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