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人淋巴毒素cDNA在大肠杆菌表达的研究 |
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T。
1.2 人LT cDNA在大肠杆菌的诱导表达 将含有pBV-LT的DH5α在30℃培养过夜，按1∶100稀释至LB培养液中，继续在30℃摇床培养至OD0.4～0.6，迅速转至42℃摇床诱生2～6 h，同时作未诱生菌和空载体对照［3］。
1.3 重组人LT的检测与鉴定 于诱生不同时相离心收集菌体，以1×SDS上样缓冲液溶解并煮沸后行SDS-PAGE，考马斯亮蓝染色，脱色后观察结果，并在DU-600型紫外分光光度计上作薄层扫描分析，以计算阳性蛋白带的相对比例。Western-blotting按常规方法进行，以抗LT McAb(宝灵曼产品)与转移至NC膜上的重组LT蛋白带作免疫印迹反应［4］。
1.4 重组LT活性测定 按文献方法分离包涵体［4］。收集42℃诱导5 h的细菌100 ml，离心后每克湿菌加3 ml TE Buffer悬浮，超声粉碎、变性、复性后浓缩至1 ml，过滤除菌、备用。MTT比色法测定LT对培养的L929细胞的细胞毒活性［5］，以已知活性单位的rTNF-α(本校大坪医院产品，活性单位20 000 U/ml)为阳性对照。
2 结果
2.1 阳性重组子的筛选与鉴定 从108个pBV220/LT转化的菌落中经地高辛标记探针筛选出5个阳性菌落，质粒快速小量抽提后经RE酶切确认，这些阳性菌落均为带有插入片段的阳性重组子，其中1个为正向插入，4个为反向插入。
2.2 重组LT的表达与鉴定 pBV-LT经诱导后，在18～19 kD处出现一新的蛋白带，其表达高峰在诱导后4～6 h，包涵体样品在同样位置有一较浓的蛋白带，与文献报道的重组LT分子量大小一致［5］，薄层扫描分析表明，重组LT蛋白带占细菌总蛋白量的12%(图1A),Western-blotting显示，仅经诱导的pBV-LT在18～19 kD处有阳性反应，表明前述蛋白带确属人淋巴毒素蛋白(图1B)。
2.3 重组蛋白的生物学活性 经MTT比色法测定，rLT与rTNF-α活性单位相当，均为20 000 U/ml，此1 ml rLT为100 ml菌液所得，因此相当于2×105 U/L菌液。
图1 重组LT的表达与鉴定
Fig.1 Expression and identification of rLT
Note:A.SDS-PAGE：Lanel,protein molecular weight markers,Lanes2 and3,pellet fraction of sonicated cells carrying the control plasmid(lane2) or pBV-LT(lane3).Lanes4,6,8 and Lanes5,7,9,total cell lysate of cells harboring pBV-LT grown at 30℃ or 42℃ for 2,4,6 h respectively.Lane10,total cell lysate of cells harboring pBV220 grown at 42℃ for 4 h.B.Western blotting.Lanes1,2,3 total cell lysate of cells harboring respectively pBV220(Lane 1,grown at 42℃ for 4 h)and pBV-LT(Lanes 2,3,grown at 42℃ for 4 and 6 h)
3 讨论
本实验将本室克隆的人淋巴毒素cDNA构建于原核表达载体pBV220,筛选出的阳性重组子pBV-LT经温控诱导，成功地表达了人淋巴毒素重组蛋白，该重组蛋白占细菌总蛋白的12%，并具有细胞毒活性，其活性单位相当于2×105 U/L菌液。本实验为rLT的大量生产和临床应用，以及进一步研究LT的功能奠定了基础。
本实验rLT表达量占细胞总蛋白量的12%，尚有进一步提高的必要，试用合适的高效表达载体，调整SD与ATG间的距离可能是有效的途径。另外，据文献报道，人LTcDNA具有多态性，即在其成熟肽第26位氨基酸有天冬酰胺(Asn,密码子AAC)和酪氨酸(Thr，密码子TAC)之分，而26位为Thr的cDNA，其蛋白表达量明显高于该氨基酸为Asn者［6］，本实验克隆的人LTcDNA正好是后一种形式。因此，通过定点突变将该编码基因由AAC改为TAC，有可能提高rLT的上一页 [1] [2] [3] 下一页
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