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血管紧张素 对心肌梗塞大鼠成纤维细胞的核酸 胶原合成影响的研究 |
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-血管紧张素系统(renin-angiotensin system, RAS),尤其是血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ, Ang Ⅱ)在MI后左室重构的发生、发展过程中起着重要作用［2］。值得注意的是，左室改建除与心肌Ang Ⅱ水平升高有关外，是否还与心脏间质细胞对Ang Ⅱ的反应性升高有关?为此，本研究通过分离、培养心肌梗塞大鼠心肌成纤维细胞(fibroblasts, Fbs)，对上述问题进行探讨。
材料与方法
(一)实验分组：选用体重220～260 g的雌性SD大鼠(本校实验动物中心提供)，随机分为MI组和假手术(sham-operation, SO)组。
(二)复制大鼠MI模型：MI模型复制采用本室已建立的方法［3］：在乙醚麻醉下，于左侧第四肋间开胸，迅速挤出心脏，MI组结扎左冠状动脉主干根部，SO组在相同部位穿线，但不结扎，术后喂养6周。
(三)成年大鼠心肌成纤维细胞分离培养：参照Brilla等的方法［4］。在无菌条件下，取大鼠心脏，去掉心房组织、大血管、心包及梗塞区，将心肌剪碎成约1 mm×1 mm×1 mm小块，加含有0.1%胰蛋白酶和0.1%胶原酶Ⅰ型(Sigma)无钙Hanks液，37℃水浴消化，弃去第一次消化所得细胞悬液，收集其余各次所得细胞悬液，离心，弃上清，将细胞转移至含10%小牛血清和双抗(青霉素和链霉素)的Eagle(Sigma)培养基中，用贴壁法分离、纯化Fbs,按107 cells/L浓度，接种培养。48 h后轻轻倒弃培养液，用不含小牛血清的Eagle培养液轻轻冲洗2遍，再加入1 mL不含小牛血清的培养基继续培养24 h，再一次行细胞计数，加入各处理因素(见下述)，于24 h后终止培养，进行处理测量。本实验所用Ang Ⅱ(Sigma)浓度为10-7 mol/L,而其阻滞剂1.8Ang Ⅱ(Sigma)和血管紧张素抗肽(Ang-AP)(Sigma)，以及1型Ang Ⅱ受体(AT1)特异性阻滞剂Losartan(Los,纽约医学院Anversa实验室惠赠)浓度均为10-6mol/L［5，6］。
(四)DNA、RNA和胶原合成率的测定：用3H-胸腺嘧啶核苷(3H-thymidine,3H-TdR)(3.7×1010Bq/L,中国原子能研究院)，14C-尿嘧啶核苷(14C-uridine,14C-UR)(0.37×1010Bq/L中国医学科学院放射医学研究所)和3H-脯氨酸(3H-proline,3H-Pro）(3.7×1010Bq/L,中国原子能研究院)掺入率来反映Fbs的DNA、RNA及胶原的合成率。同位素标记物的用量分别为：3H-TdR,1.0 3.7×104 Bq培养瓶；14C-UR,0.1 3.7×104 Bq培养瓶；3H-Pro,1.0 3.7×104 Bq培养瓶。具体方法同文献报道［5］。用均相法进行液闪测量，并通过内标准源法进行淬灭校正，计算出各样本3H和14C的实际衰变率(dpm/104cells)。由于成纤维细胞胶原代谢率较慢，故3H-Pro掺入率较低，为了降低测量误差，每份样本测量时间均在10 min以上，结果以counts*min-1/104cells表示。测量误差＜±5%。
(五)统计处理：实验数据均用均数±标准差(±s)表示。采用多样本均数两两比较的方差分析，方差不齐者用变量变换。
结 果
不同处理因素对培养心肌Fbs的DNA、RNA和胶原合成率的影响：
如表1～3所示，相同浓度(10-7mol/L)的Ang Ⅱ，均显著地提高SO组和MI组Fbs的3H-TdR、14C-UR和3H-Pro掺入率(P＜0.05),而且对MI组Fbs的作用又显著大于SO组(P＜0.05)。Ang Ⅱ的作用可被1.8Ang Ⅱ和Ang-AP完全阻断，而Losartan不能完全阻断Ang Ⅱ的作用，表现为该处理组3H-TdR、14C-UR及3H-Pro的掺入率均显著低于Ang Ⅱ组(P＜0.05)。但仍显著高于磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution, PBS)对照处理组。结果还显示，Ang Ⅱ+Los处理组，MI组的上述3种底物掺入率仍显著高于SO组(P＜0.05)。
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