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生长激素诱导心肌细胞外信号调节酶激活及其上游调控 |
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cascade in cardiac myocytes was dependent on upstream Ras, but not affected by the changes of PKC activity and PKC quantity in cardiomyocytes.
MeSH Hormones, growth; Signal transduction; Myocardizum
近年，国外有学者偿试用生长激素(growth hormone, GH)治疗扩张性心肌病和充血性心力衰竭。发现GH能增加心肌质量，缩小心腔容积，增强心肌收缩力，改善血流动力学指标，而不伴心率和耗氧量的增加［1］。然而GH的这些有益的心脏效应机制尚不清楚。
丝裂素原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPKs)是一个重要的细胞内信号传导酶超家族。其成员酶——细胞外信号调节酶(extracellular signal-regulated kinases, ERKs),是一个与细胞生长、增殖、分化甚至保护机制有关的重要信号分子［2］。本研究用重组人GH(genotropin)刺激新生鼠心肌细胞，测定ERK活性变化，并采用负显质粒(dominant-negative mutant plasmide)转染试验和抑制剂研究，探讨GH诱导ERK激活的上游调控机制。
材料与方法
1.材料：重组人GH(genotropin)由Mitsui Toatsu Chemical Inc提供。［γ-32P］ATP购于Du Pont新英格兰核公司(Boston, MA)。培养基DMEM和胎牛血清(FBS)购于GIBCO BRL公司。抗血球凝集素(hemagglutinin, HA)多克隆抗体由日本Mitsubishi生化实验室赠送。Calphostin C购于Biomol公司。12-O-tetradecanolphorbol-13-acetate (TPA)和 myelin basic protein (MBP)以及其它试剂均由Sigma化学公司提供。
2.cDNA质粒：SV40起动子调控的HA-ERK2由Karin赠送。负显突变(Asn-17)质粒(Dominant-negative mutant Ras, D.N.Ras)由Takai赠送。QIAGEN质
粒DNA制备药盒由Chatsworth提供。
3.心肌细胞培养：取1日龄新生Wistar鼠心室肌，按Simpson等的方法略加修改，进行心肌细胞原代培养［3］。用差速贴壁分离法去除非心肌细胞。置心肌细胞于含10% FBS的DMEM液中，调细胞密度为1×105／cm2培养24 h后，换成0.1% FBS的培养液继续培养48～72 h，再进行各种刺激。
4.质粒DNA转染：心肌细胞原代培养24 h后，用磷酸钙方法进行质粒DNA转染［3］。每皿加2.5 μgHA-ERK2 质粒，实验组同时加入7.5 μg D.N.Ras质粒进行复合转染，14 h后抽去培养液，用磷酸盐缓冲液洗二次，再加0.1% FBS培养液，继续培养48 h，然后进行GH刺激。
5.ERK活性测定：用含MBP凝胶电泳和放射自显影法测ERK活性［4］。用细胞溶解缓冲液(含25 mmol/L Tris-HCl pH 7.4,25 mmol/L NaCl, 1 mmol/L sodium orthovanadate, 10 mmol/L NaF, 10 mmol/L焦磷酸钠，10 nmol/L Okadaic acid, 0.5 mmol/L EGTA和1 mmol/L PMSF)溶解心肌细胞。4℃ 12 000 r/min离心20 min。取上清测定蛋白含量，调节蛋白质浓度。点样于含0.5 g/L MBP的SDS-PAGE进行电泳。去除凝胶SDS后，用6 mol/L盐酸胍使酶蛋白变性，再用50 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0,含0.04% Triton X-100和5 mmol/L 2-巯基乙醇)使酶蛋白复性。凝胶再与含92.5×104 Bq［γ-32P］ATP反应1 h，充分洗涤，干燥凝胶。放射自显影观察MBP磷酸化带。用密度仪扫描测定MBP磷酸化带的放射强度，该数据代表ERK活性。
6.HA-ERK2活性测定：用免疫沉淀和放射自显影法测转染表达的HA-ERK2活性［4］。心肌细胞溶解抽提物与抗HA抗体于4℃孵育1 h上一页 [1] [2] [3] 下一页
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