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从胚胎干细胞诱导发育为浆细胞的体外实验研究 |
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pment of ES－D3 cells,conditional medium of the first stage of liquid culture could accelerate them to develop into hematopoietic cells,and the primary bone marrow stromal cells play a main role in the induction of plasma cells.
MeSH Embryo;Stem cells;Cytokines;Hematopoietic stem cells;Plasma cells
胚胎干细胞(embryonic stem cells,ES cells)是从早期胚胎细胞分离的，能在体外长期培养的，高度未分化的细胞。胚胎干细胞的建立，为人们在体内外研究胚胎及器官发育带来方便。体外悬浮培养ES细胞，可形成富含造血岛的胚胎体［1］，造血岛内主要是原始红细胞，可检测到克隆形成细胞(colony forming cells，CFC)。有关ES细胞向B淋巴细胞发育的研究较少，Nisitani等将发育7 d的胚胎体的细胞移至ST2成纤维细胞上，可检测到有重组激活基因(RAG)的转录及D－J基因的重排［2］，Potocnik等在低氧的环境中使ES细胞发育，15～20 d后也可检测到V－D－J基因重排及B220＋的B淋巴祖细胞［3］，但以上两种方法均未检测到成熟B淋巴细胞和浆细胞。本实验采用分阶段诱导胚胎干细胞发育的方法，探讨骨髓基质细胞饲养层及细胞因子对胚胎干细胞发育的影响，建立ES－D3细胞在体外定向诱导分化为浆细胞的体系，为体外研究造血细胞发育奠定基础。
材料与方法
一、材料：
1.ES－D3［5］由上海细胞生物学研究所丛笑倩教授提供。
2.免疫组化试剂盒购自福州迈新公司。
3.FITC－conjugated rat anti-mouse CD34和PE－conjugated rat anti-mouse CD38均购自美国Pharmingen公司。
4.干细胞因子(stem cell factor,SCF)、白细胞介素3(interleukin 3,IL－3)、白细胞介素6(interleukin 6,IL－6)、红细胞生成素(erythropoietin,Epo)等造血刺激因子由麒麟医药公司提供。血小板生成素(thrombopoietin,TPO)由杭州九源基因工程有限公司提供。
5.胎牛血清购自美国Hyclone公司。
6.昆明鼠由本校动物中心提供。
二、方法：
(一)细胞培养：
1.ES－D3细胞培养及原代胚胎成纤维细胞的制备见参考文献［9］。
2.骨髓基质细胞饲养层的制备：取6～8周的昆明鼠，取其股骨，用1 mL注射器冲出骨髓，DMEM液离心洗涤2次，接种于50 cm2的塑料培养瓶内。使用前用丝裂霉素C处理1 h，传入24孔塑料培养板内，加培养液备用。
3.胚胎细胞条件培养液(conditional medium)的制备：使5×107／L ES－D3细胞在IMDM(Iscove modified dulbecco s medium)液中培养，加入15%FCS，2－ME(10－5 mol/L)，3 d收集培养液，离心取上清，0.22 μm滤膜过滤后备用。
(二)分阶段诱导ES－D3细胞发育为浆细胞：
1.第一阶段：将1×107／L ES－D3细胞培养于含15%FCS，0.9%甲基纤维素的IMDM液内(6孔板)，分5组(表1)，每组设3个孔，分别加入β－巯基乙醇(10－5mol/L)、SCF(50 μg/L)、Epo(4×103 U/L)、TPO(100 μg/L)、IL－3（50 μg/L)、IL－6（50 μg/L)和胚胎细胞条件培养液(25%)，4 d在倒置显微镜下观察。实验重复3次。
2.第二阶段：用PBS液吸打第一阶段培养形成的胚胎体(见表1第4组)，离心沉淀，胰蛋白酶消化，吹打成单个细胞，分为3组(表2)，分别加入SCF(50 μg/L)、TPO(50 μg/L)，条件培养液(25%)及2－ME(10－5mol/L),以不同的细胞密度培养于六孔培养板中，发育3～4 d。
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