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低浓度H2O2对肺微血管内皮细胞的迟发效应 凋亡 |
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组织块，继续培养。见铺路石状细胞长出，直至融合。经鉴定后用于研究。
鉴定：倒置显微镜观察活细胞并摄影。细胞经戊二醛固定后扫描电镜观察。刮下细胞，离心、收集细胞，经包埋、切片、染色后，透射电镜观察。
长至融合状态的细胞，经多聚甲醛固定后，用vWF相关抗原抗体及内皮细胞特异性抗体CD31(DAKO公司)经常规ABC免疫组化法染色。
二、H2O2对PMVEC的作用：
1.不同浓度的H2O2对PMVEC生长代谢的影响：长至融合状态的PMVEC，经消化后，计数，以8×104／mL细胞种于96孔板中。细胞贴壁后，DMEM洗一次，8孔一组，分别加入如下H2O2DMEM溶液：0，5，10，20，50，100 μmol/L，培养1 h后，再以DMEM洗细胞一次，加入含血清完全培养液继续培养24 h，用MTT法测定细胞生长代谢特性。
同一96孔板中另6组，加入上述不同浓度H2O2培养1 h后，立即行MTT法测定。
MTT法：四氮甲基唑蓝(MTT，Sigma)用pH7.2的PBS配成5 g/L。待测细胞每孔100 μL培养液中加MTT液10 μL，37 ℃孵育4 h，镜下可见紫蓝色针状结晶。弃上清液，每孔加100 μL二甲基亚砜(DMSO)。用ELISA读数仪(Biorad 450)于波长540 nm处读取OD值。
2.H2O2对PMVEC作用的形态学观察：不同浓度H2O2作用于PMVEC不同阶段及去除作用后72 h，于倒置显微镜下观察，并作Giemsa染色、光镜观察。
PMVEC于25 cm2培养瓶长至融合状态，加入100 μmol/L H2O2，培养1 h，换含血清完全培养液继续培养3 h，经固定后，常规电镜观察。
3.H2O2对PMVEC作用去除后，细胞凋亡的观察：
(1)流式细胞仪DNA测定：PMVEC于25 cm2塑料培养瓶长至融合后，加入100 μmol/L H2O2培养1 h。去液、经DMEM洗后换入含血清完全培养液3 h。消化、固定、PI染色后，用FACSplus流式细胞仪测定。
对照组以DMEM及完全培养液代替H2O2，其余同实验组。
(2)3’末端标记，DNA降解片断检测(TUNEL法)：将小盖玻片置于直径3.5 cm的玻璃培养皿中，PMVEC于盖玻片上长至融合状态，加入0，50，100 μmol/L H2O2培养1 h，去液，经DMEM洗后，换入含血清完全培养液培养3 h，固定，用程序性细胞死亡试剂检测盒(华美公司)染色。具体步骤见说明书。然后计数6个视野中每100个细胞中染色阳性的细胞数(%)。
结 果
一、PMVEC培养及鉴定：
接种的肺组织块周围，48 h已可见少量铺路石状细胞长出，并有形状圆而小的血细胞生长，60 h弃组织块时，各组织块周围的血细胞基本消失，铺路石状细胞大量生长，极少见长梭形细胞。
扫描电镜下，主要的细胞呈多角形，少量突起，符合内皮细胞的形态学特征。透射电镜下可见各种常见细胞器，但细胞浆中维氏小体未见，这与大鼠肺微血管内皮细胞vWF染色阴性相符。内皮细胞特异抗原(CD31)染色，细胞浆阳性着色。
二、H2O2对PMVEC的作用：
1.MTT法结果：MTT为一种四氮唑蓝盐(tetrazolium salt)，它可在细胞线粒体中分解成formazan，后者溶解后很容易用ELISA读数仪定量。细胞活性越强，产生的Formazan越多，因此它是一种较好的反映细胞增殖代谢活力的指标。PMVEC经H2O2作用1h后，立即测定(0 h)或继续用完全培养液培养24 h后测定(24 h)，结果见图1：
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