|
杂色曲霉素诱导体外培养人外周血淋巴细胞凋亡的研究 |
| |
肿瘤高发区人群免疫机能的影响，本研究以流式细胞术(flow cytometry, FCM)、形态学观察及分子生物学分析相结合的方法，研究了ST对体外培养的人外周血淋巴细胞凋亡的影响。
材料与方法
(一)淋巴细胞的分离与培养：以人淋巴细胞分离液(上海试剂二厂生产)分离健康献血员外周血淋巴细胞，在以生理盐水洗去分离液后，加入含15%小牛灭活血清、青霉素1×105 U/L、链霉素100 mg/L和PHA 25 mg/L的RPMI 1640培养基(美国GIBCO公司)，调整培养淋巴细胞浓度至4×108细胞/L，接种于25 mL螺口培养瓶中，置37℃、含体积分数为5%CO2恒温箱中培养。
(二)实验分组及处理：淋巴细胞体外培养48 h后，以不含PHA的新培养液更换含PHA的培养液，将培养瓶随机分组。分别进行下列实验：实验Ⅰ 实验组加入终浓度2 mg/L的ST(SIGMA)溶液，相应对照组加入等量生理盐水；分别在毒素处理第2、4、6、12、24、36、48及72 h各收集2瓶细胞，PBS离心洗涤，体质分数为70%乙醇固定。实验Ⅱ 实验组加入不同剂量的ST溶液，使其终浓度分别为0.125 mg/L、0.25 mg/L、0.5 mg/L、1.0 mg/L、2.0 mg/L、3.0 mg/L，每一浓度4瓶；相应对照组分别加入与上述各浓度组ST溶解液等量的生理盐水；分别在ST处理后第6及24 h，每一浓度组和对照组各收集细胞2瓶，PBS离心洗涤，体质分数为70%乙醇固定，置于4℃冰箱保存，待制样进行FCM检测。另取ST 2.0mg/L处理6及24 h的实验及对照组细胞，制备电镜及DNA样品。实验Ⅰ重复3次，实验Ⅱ重复2次。
(三)细胞DNA含量的定量检测及分析：按张祥宏等［5］ 的方法制备单细胞悬液及细胞DNA染色，FACS-420型流式细胞仪(美国B.D公司)检测细胞DNA含量，应用DNA单组方图统计软件进行资料处理，以出现DNA亚二倍体峰作为细胞凋亡标志，计算凋亡细胞百分率。以POMS统计软件进行统计学处理。
(四)形态学观察：取ST 2.0mg/L处理6及24h的实验及对照细胞，常规方法制备电镜样品。分别切取1μm半薄切片和50nm超薄切片，0.15%甲苯胺蓝染色和铀-铅染色，光镜及H-500透射电镜(日本日立公司)观察细胞的形态变化。
(五)细胞DNA琼脂糖凝胶电泳：取ST 2.) mg/L处理6及24h的实验及对照细胞，常规方法提取细胞DNA，溶于10 μL TE缓冲液中；1×TAE电泳缓冲液，1%琼脂糖凝胶，恒压30～40 V电泳2 h，EB 5 mg/L染色后，观察DNA泳动带型，紫外透射摄影。
结 果
一、FCM检测结果：
(一)ST处理不同时间对淋巴细胞凋亡的影响：
由表1可见，经ST处理后，淋巴细胞凋亡率比对照组明显升高；随处理时间的延长，细胞凋亡率呈逐渐增高趋势，细胞凋亡率和处理时间的延长，细胞凋亡率呈逐渐增高趋势，细胞凋亡率和处理时间在2～48h呈明显正相关关系(r=0.9629,P＜0.01)。
(二)不同浓度的ST对淋巴细胞凋亡率的影响：
在ST 0.125～1.0 mg/L浓度范围内作用6h及24h，淋巴细胞凋亡率随ST浓度增加有不同程度的增高，呈明显量效关系(6 h:r=0.7788,P＜0.01;24h：r=0.9827,P＜0.01)(图1)
Fig 1 Apoptosis of lymphocytes after 6 h of ST treatment (+s,n=6)
图1 不同浓度的ST处理6 h后细胞凋亡情况
表1 ST(2 mg/L)处理不同时间后淋巴细胞凋亡率变化
Tab 1 Changes of apoptotic rates of lymphocytes
in different times after ST treatment (%,±s,n=8)
Treating time (h) Control ST
上一页 [1] [2]
上一个医学论文： 边缘系创伤反应性髓鞘碱性蛋白表达与超微结构观察
下一个医学论文： 低浓度H2O2对肺微血管内皮细胞的迟发效应 凋亡
|
|
|
|
|
|
|
您现在的位置： 绿色健康网 >> 医学论文 >> 基础医学论文 >> 正文