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应用荧光原位杂交 FISH 技术研究黑叶猴染色体易位 |
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带,FISH技术为人类染色体畸变的研究提供了更为精确而可靠的手段,如确认一些常规G显带难于分辨或觉察的染色体缺失、重复及复杂而细微的相互易位等,同时也为染色体的易体性重排、重复、缺失或插入性重排等确定类型、来源和断裂点提供可靠的依据[15]。
野生动物细胞株在长期深低温冻存和传代过程中，一些细胞株的染色体会发生二倍体数目的增减、 染色体结构的改变以及多倍体细胞的增加等畸变。因此,细胞库以深低温保存技术保藏的细胞株需要定期进行质量监测,以保证提供特征清楚、标准化的实验材料。其中较重要的监测指标就是细胞株的核型,因为核型具有物种的属性,是种系鉴别中的一个非常重要的特征。常规的染色体显带技术在细胞库冻存细胞株质量控制中发挥了重要的作用。但常规染色体显带技术对畸变染色体的来源和断裂点等有时难于作出准确判断。对于一些发生畸变的珍稀动物细胞株,建立一种快速而准确可靠的检测染色体畸变的方法是十分必要的。本文在应用 FISH 技术研究人和黑叶猴(Semnopithecus francoisi)染色体同源性的过程中,发现并确定了一例黑叶猴染色体易位,证明利用人整条染色体特异探针的FISH技术同样适用于灵长类细胞株染色体畸变的检测。本工作目的在于探索建立在常规G 显带标本上利用人整条染色体探针进行荧光原位杂交以检测灵长类动物细胞株染色体畸变的实验方法。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料 黑叶猴细胞株(KCB 92008)是由EB 病毒体外转化外周血淋巴母细胞获得的传代细胞株,现保存于中国科学院典型培养物保藏委员会昆明细胞库。
1.1.2 探针 生物素标记的人9号和14号染色体特异性探针,由英国剑桥大学病理系博士杨凤堂先生提供。
1.1.3 试剂 FITC(fluorescein isothiocyanate)标记的Avidin,生物素标记的抗avidin 为Vector Laboratories产品。PI(propidiumiodide) 和甲酰胺(Formamide)来自SIGMA 公司。人COT-1 DNA为BRL产品。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养及染色体制备 培养基组成: RPMI 1640(日本,日水制药株式会社) 85%,新生牛血清15% 。黑叶猴细胞株的培养按本库常规方法进行。染色体标本制备按常规空气干燥法进行。
1.2.2 G带的显示 G带按 Zhu等(1993)的方法进行。在油镜下检出适当的G带中期分裂相,用富士黑白胶卷照相并记下其相应的座标,以便杂交后辨认探针在染色体上的杂交部位。
1.2.3 原位杂交、荧光放大和检测 主要参照Lichter等 (1988) 的方法稍加修改进行。1μl 100-150ng/ml生物素标记的人染色体特异探针和1μl 人COT-1 DNA与10μl 杂交缓冲液混合后在65℃水浴中变性10 min,然后在37℃水浴中预退火60min。玻片在65℃70%的甲酰胺/2×SSC溶液中变性2 min,立即浸入-20℃70%乙醇中2 min,再经过常温下的80%、90%、100% 乙醇系列脱水。在玻片上加预退火的探针溶液,加盖玻片,橡胶水封片后放入37℃湿润暗室中杂交过夜。
杂交后玻片在 42℃50 %甲酰胺/2×SSC 洗涤液和2 × SSC 液中各换洗2次,每次5 min。在37℃含5%脱脂奶粉和 0.05%Tween-20的4×SSC溶液中温育30 min,然后用含5%脱脂奶粉和 0.05%Tween-20的4×SSC溶液配制的FITC-avidin(1:500) 和生物素抗avidin (1:250)抗体在 37℃湿润暗室中交替处理玻片标本3次,每次20min,进行荧光放大。在每次处理后,用含0.05% Tween-20的 4×SSC溶液换洗 3 次,每次5 min。玻片经乙醇系列脱水后空气干燥,再用0.1μg/ml PI 溶液复染,加盖玻片,橡胶水封片。
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