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以胞质分裂阻滞法研究女性年龄与体细胞中21号染色体分离异常的关系 |
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另文报道的方法进行YAC DAN的分离、扩增, 并用BIOTIN-16-dUTP经PCR标记后用作荧光原位杂交探针。
1.2 实验对象
31例健康女性，不嗜烟酒，按年龄分组如下：I组0～10岁，7人，平均年龄4.40岁；Ⅱ组20～30岁，9 人，平均年龄25.78岁；Ⅲ组40～50岁，8人平均年龄45.13岁；Ⅳ组60～70岁，7人，平均年龄 64.57岁。抽取每例的外周静脉血2ml，按常规方法建立淋巴细胞培养物。
1.3 培养细胞的处理
在培养至第44小时，加入细胞松弛素B(Cytochalasin-B)(Sigma)至终浓度为 6 μg/ml，避光培养至72小时，收获细胞。
1.4 原位杂交
1.4.1 标本预处理 空气干燥法制片，于Carnoy液中固定1小时。系列乙醇(70%，90%，100%)脱水;42℃干燥过夜。蛋白酶K(1μg/ml，于20mM Tris-HCl，2mmol/L CaCl2中)消化10分钟 (37℃)。PBS洗5分钟。4%甲醛固定。系列乙醇(70%，90%，100%)脱水。
1.4.2 探针变性 取标记好的探针, 按200ng/μl加入杂交液(50%甲酰胺, 10％硫酸葡聚糖, 50mmol/L PBS, 2×SSC)。取4μl探针液, 加6μl人胎盘DNA(10mg/ml溶解于杂交液中, 超声打碎至小于1kb)。75℃变性8分钟，37℃预杂交20分钟，然后置冰浴中待用。
1.4.3 标本变性及杂交 标本于65℃变性液(70%甲酰胺，2×SSC)中处理2分钟，系列乙醇 脱水。将变性后的探针液置于标本上，加盖片，石蜡封闭边缘后，置37℃湿皿中杂交过夜。
1.4.4 检测 去盖玻片，将标本依次置预温至42℃的 50%甲酰胺(4×SSC)和2×SSC 中各两次, 每次5分钟。依次加avidin-FITC，小鼠anti-avidin-FITC和兔抗鼠Ig-FITC 20 μl, 37℃孵育30 分钟, 其间分别在Tween-20(0.05% in 4XSSC)中洗两次, 每次5分钟。PI/Antifade(100 ng/ml)染色。
1.5 镜检
用Olympus BH-2荧光显微镜观察，每例分析1 000个细胞膜完整的双核细胞。记录子核及微核(如果有)中的信号点数及微核数 。
1.6 统计学处理
用线性回归法分别判断微核率、染色体不分离率与年龄间的关系。用χ2检验判断微核率和染色体不分离率等在不同年龄组间的差异。
2 结 果
不同年龄组正常女性的外周血淋巴细胞培养物, 经Cyt-B处理可获双核细胞；用21号染色体特异的近着丝粒DNA探针与之进行荧光原位杂交, 可观察到细胞中21号染色体的数目及在一次细胞分裂时的分离情况。根据二倍体双核细胞中杂交信号点在子核及微核(如有)中的分布即可同时确定21号染色体的不分离和/或丢失(图1)。
图1 以21号染色体特异性探针对双核细胞进行荧光原位杂交
a. 正常分离,每个子核中两个信号点;
b. 不分离, 一个子核中三个信号点，另一个子核中一个信号点;
c. 染色体丢失, 一个子核中两个信号点，另一个子核中一个信号点, 微核中一个信号点;
d. 21三体细胞正常分离, 每个子核中三个信号点。
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