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ENU诱导带LacZ靶基因的 gt11 DNA突变分子机理的初步研究 |
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kage, Mutagen sequencing, DNA squence
近年来，靶基因开始被引入遗传毒理学领域，用以构建DNA分子致突变检测系统和开展分子突变机理研究，使用靶基因的最大优点是在检测突变物的同时，能在DNA分子水平上获取突变的直接证据。
我室在前期课题研究中，曾提出在试管中用致突变物直接处理 λ DNA，再于体外进行重包装，最后以噬菌斑形成率下降作为突变检测终点〔1, 2〕]。但是，原有研究由于未引入必要的靶基因和/或标志基因，因此难以排除部分假阳性和进一步开展分子突变机理研究。本课题以lacZ为靶基因，通过计数不同颜色噬菌斑来反映突变率，并进一步对突变噬菌体进行扩增和测序, 以开展DNA分子突变机理分析。
1 材料和方法
1.1 菌株基因型鉴定和包装蛋白的制备
对制备包装蛋白的菌株BHB2688、BHB2690（均由中山大学刘良式教授惠赠）分别进行CIts 857基因、rec A- 基因和Sam基因鉴定。BHB 2690用超声破壁法制备前头部蛋白；BHB 2688使用溶菌酶-冻融破壁法制备尾部蛋白。将制备产物分别以15μl/管、10μl/管分装，液氮中冻结后迅速置入液氮或-70℃长期保存。方法参照《分子克隆操作指南》第二版。
1.2 包装效率的确定
运用制备的包装蛋白对 λ DNA进行重包装，以E. coli LE 392为宿主菌，以包装1μg λ DNA产生的噬菌斑数计算为包装效率。
1.3 诱变剂处理 λgt11 DNA〔3〕 和 λ DNA体外重包装
将0.5μg λ gt11 DNA溶于5μl 10mmol/L Tris-HCl(pH7.9)和10mmol/L MgCl2 中, 加入5μl ENU受试物，剂量分别为500μg、650μg、750μg及850μg/5μl, 溶剂为DMSO，搅匀，37℃温育30min，置冰上10min终止反应。取出深低温下保存的包装蛋白， 冰上融化，将先融化的BHB 2688转移至仍处于冰冻的BHB 2690中。当已合并的包装蛋白即将全部融化时，加入0.5μg λgt11 DNA，22℃，2h。加SM液0.5ml，氯仿25μl，颠倒混匀。取200μl Y1090菌液对应加入稀释后的噬菌体液10μl，混匀，37℃20min。将上层琼脂(含10mmol/L MgSO4, 47℃, 约3ml)中加入35μl X-gal (20mg/ml)、3.5μl IPTG(20%)，铺皿。42℃, 12～16h后计数蓝色噬菌斑数及清亮噬菌斑的比例。
1.4 阳性突变体的再鉴定
吸取单个清亮噬菌斑，移入SM液1ml中，室温1h。取10μl加入200μl Y1090菌液或50μl MgSO4沉淀悬浮液中，37℃，20min。加入3ml顶层琼脂(47℃，含X-gal及IPTG)，铺皿，42℃培养过夜。
1.5 λ DNA突变体的提取、扩增及纯化
操作按Promega λ DNA 纯化试剂盒说明进行，用平板裂解物法提取 λ gt11 DNA突变体，将提取物溶于TE中，4℃或-20℃长期保存。
1.6 纯化的 λ gt11 DNA中lacZ基因的部分PCR扩增
以 λ gt11 DNA为模板，选用分别位于LacZ基因1 965～1 989bp处的引物1, (LacZ基因的第1个碱基为1)序列为5 -GGT GGC GCT GGA TGG TAA GCC GCT-3 , 及位于2980bp处的引物2, 序列为5 -GGT GGC GAC GAC TCC TGG AGC-3 , 在25μl反应体系中做PCR扩增。
1.7 PCR产物的测序
突变子的PCR产物用荧光标记的自动测序法测序。每个样品一次读取260个碱基(从#FKLacZ#FS基因的第2 026 bp～2 286 bp)。
2 结果与讨论
2.1 ENU对 λgt11 DNA存活率及lacZ基因突变率的影响
ENU是肯定的DNA点突变剂，常用于基因突变研究的阳性对照，在本研究中，为增加作用的灵敏度，ENU直上一页 [1] [2] [3] 下一页
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