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细菌感受态细胞摄取和分泌DNA的相关性研究 |
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)：葡萄糖 5g；MgSO4.7H2O 0.2g ；(NH4)2SO42g；K2]HPO4.3H2O 18.34g；KH2PO4 6g；柠檬酸钠.2H2O 1g。
选择培养基：Spizizen基本培养基补加50μg/ml Met和20μg/ml Trp。固体培养基另加琼脂粉至1.5%。
1.3 方法
1.3.1 B. subtilis总DNA及质粒DNA制备纯化方法参见文献〔7, 8〕改进。
1.3.2 pUB110质粒转化BR151菌株的方法参见文献〔9〕。
1.3.3 诱变方法参见文献〔10〕。以亚硝基胍(N-methyl-N -nitro-N-nitrosoguanidine, NG or NTG)作诱变剂，直接在LB平板上进行诱变。
1.3.4 筛选方法参考文献〔9, 10〕。
1.3.5 染色体DNA液体转化方法参见文献〔9〕。
1.3.6 UV敏感性检测方法参见文献〔4, 9, 11〕。
2 结果和讨论
2.1 出发菌株的选择
为了获得用以研究自然感受态的建立与DNA（特别是质粒DNA）分泌的关系为目的的感受态缺陷突变株，其出发菌的选择至关重要。因为所获得的缺陷型不仅要稳定，而且还要有利于DNA分泌的研究。因此我们选择了具有多重营养缺陷（trp-、met- 和lys-）标记，能自然建立感受态的枯草芽孢杆菌BR151为出发菌株，并将pUB110质粒（Kmr）导入其细胞内，构建成含有质粒、具多重营养缺陷及Kmr的出发菌株，称之为BR151p。在这样的选择压力下，可使获得的突变株稳定，且保持所含质粒。
自然感受态缺陷型的选择标准是看其是否丧失或降低了摄取外源DNA的能力。我们选择来自枯草芽孢杆菌168（trp-、ilv- 和pyr-）的总DNA为转化DNA，在选择平板上进行筛选。经诱变处理后的BR151p在选择平板上不能生长或生长很差者，可初步判断它们感受态建立受阻，不能摄取和表达外源DNA，然后可再经多次重复和复筛进一步确证。
2.2 感受态缺陷型的筛选
将固体NTG直接点于涂布有BR151p的LB平板上，经37℃过夜培养后，从NTG抑菌圈边缘，刮取菌苔稀释涂布于LB平板，挑单菌进行筛选。
从2949个菌落中获得727个在点有168菌株总DNA的选择平板上不长而在LB平板上生长的菌落，经进一步复筛，从中获得52个菌落，再进行液体转化实验，得到7个转化频率低于出发菌株1个数量级以上的突变株，其中BR151pm转化频率低于出发菌株2～3个数量级（图1）。
图1 转化频率变化
2.3 突变株的鉴定
2.3.1 自然感受态的变化 BR151pm、BR151p和BR151菌株在相同条件下生长表现一致，转化频率变化趋势相似，经多次传代进行液体转化实验，BR151pm菌株转化频率均低于BR151p和BR151菌株2～3个数量级（图1），结果稳定。
2.3.2 遗传标记检测 BR151pm菌株在补加Met、Trp和Lys的Spizizen基本培养基上可以生长，且必须此三种氨基酸，与BR151p菌株的营养要求一致，这说明BR151pm菌株转化频率的降低不是由于产生新的营养缺陷形成共转化所致。而很可能是负责感受态建立的某些基因发生了突变。该突变株仍保留着原来的选择标记，符合进一步研究的要求。
2.3.3 UV敏感性检测 为了进一步证实我们所获得的转化频率降低的突变确实是因为感受态缺陷所致，我们进一步进行了UV敏感性检测。因为建立自然感受态的细胞摄取的外源DNA需经过同源重组才能整合到染色体上，重组缺陷会导致外源DNA无法有效整合，使转化频率降低。重组缺陷型菌株对UV造成的DNA损伤的修复能力低于非重组缺陷型菌株，因此, 对UV的敏感性与非重组缺陷型菌株不同，故可利用对UV敏感性的变化来判断其是否为重组缺陷〔4, 9, 11〕 。
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