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基因靶位操作的技术与应用 |
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因neo 插入载体的目的基因片段中，负选择基因HSV-tk 置于目的基因片段的外侧。neo 基因具有双重作用，一方面形成靶位基因的插入突变，同时作为重组转化细胞的正选择标记；HSV-tk基因是负选择基因，含tk基因的重组转化细胞在含GANC的培养基中不能存活。正负筛选方法基因靶位操作载体的设计基于如下发现，即外源线性DNA片段在基因组中的随机整合是通过两个末端的插入连接完成的，其结果是整个外源DNA片段全部进入基因组中，同源重组则在DNA同源顺序之间进行，非同源部分在重组交换中被切除〔14〕。这样，同源重组的转化细胞含neo 基因，而位于同源顺序外侧的HSV-tk基因被切除，因此重组转化细胞具有G418和GANC的双重抗性，非同源重组的靶细胞，因含有通过末端插入而整合的HSV-tk基因，在GANC选择培养基中不能存活。应用正负筛选方法可在极大程度上富集筛选同源重组转化细胞克隆。Capecchi和Mansour采用此方法，已完成鼠ES细胞Hprt、int-2、hox1.2和hox1.3等基因的定点突变〔13，
14〕。由于正负筛选方法具有广泛的适用性，它将在基因功能研究方面发挥重要作用（图2）。
图2 正负筛选方法
2 基因靶位操作效率的影响因素
基因靶位操作的效率可用绝对效率和相对效率两种方式表示，绝对效率指发生同源重组的细胞数与处理的总细胞数之比，相对效率则指发生同源重组的细胞数与发生随机整合的细胞数之比。基因靶位操作效率在不同的研究报道中变动范围很大，比较不同实验室的基因靶位操作效率非常困难〔14〕。基因靶位操作效率的波动性来自诸多的影响因素。
2.1 基因靶位操作载体的影响
基因靶位操作载体包括载体骨架、靶位基因同源顺序和突变顺序或选择标记基因等非同源顺序，其中，同源顺序是决定同源重组效率的关键因素。Thomas和Capecchi首先开始这方面的研究 〔2〕，当载体同源顺序长度从4kb增加至9kb时，基因靶位操作效率增加10倍；与此同时，非同源重组效率增加40倍。其他研究者也得到类似实验结果〔15～17〕。同源顺序长度对同源重组效率的影响机制尚不清楚，一般认为，较长的同源顺序有利于DNA分子间的同源识别和杂合DNA链的形成；也有人认为〔16〕，突变基因两侧较长的同源顺序可以经受住细胞内源核酸酶的降解，在到达细胞核后仍保留足够长的同源顺序以完成同源重组。Hasty等〔17〕的研究发现，同源顺序到达一定长度后，继续的增长对同源重组效率不产生显著影响。对这一现象的两种解释是：足够长度的同源顺序可能包括重组热点，类似于E. coli 染色体中的Chi位点，从而提高同源重组效率；另一种可能则是同源重组要求一定绝对长度的同源顺序，长度继续增加对同源重组效率影响不大。一般这一长度在10kb左右〔2〕。
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