|
基因靶位操作的技术与应用 |
| |
汪亚平 朱作言
The Approach and Application of Gene Targeting
WANG Ya-Ping ZHU Zuo-Yan
(Institute of Hydrobiology, The Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430072)
1 基因靶位操作的筛选系统
哺乳类细胞基因靶位操作中，同源重组效率低下是其主要技术障碍。在Hprt基因的模型研究基础上，逐渐形成基因靶位操作筛选策略框架〔1～3〕。80年代中期，发展了多种筛选策略，以满足哺乳类细胞内源非选择性位点的基因靶位操作研究。这些方法可分为两类：物理筛选方法和遗传筛选方法。
1.1 物理筛选方法
PCR方法建立以后，很快应用于基因靶位操作中转化子的筛选。通过在目的突变基因中引入特定的PCR引物顺序，利用PCR方法直接检测转化细胞组份或细胞克隆的DNA结构，以特定扩增DNA片段的有无，鉴别同源重组细胞克隆。Kim和Smithes首先应用PCR方法成功筛选出ES细胞Hprt基因的定点突变克隆〔4〕。随后，Joyner等应用同样的方法，对小鼠ES细胞的en-2 基因进行了定点突变〔5〕；Zimmer等用PCR方法筛选出同源异型盒基因Khox1.1定点突变的ES细胞克隆，并得到含该突变的嵌合体小鼠〔6〕。
1.2 遗传筛选方法
1.2.1 正向筛选方法 正向筛选方法通过基因靶位操作特殊的载体设计，使正向选择基因仅在同源重组转化子中表达，从而可在选择培养基中筛选转化子细胞克隆。鉴于这一特殊设计，正向筛选方法只适用于在靶细胞中能正常表达的基因。正向筛选方法的载体设计涉及基因表达调控的两个主要元件，启动子和转录终止顺序。
(1) 启动子缺失筛选方法: 在基因靶位操作载体的目的基因片段中插入启动子缺失的正向选择基因neo，目的基因片段亦不包括该基因的启动子区域。目的突变基因片段与基因组靶位基因间的同源重组，使正向选择基因能在基因组靶位基因启动子的驱动下，表达功能性基因产物，使转化子细胞具有G418抗性，从而可在G418培养基中筛选出同源重组细胞克隆。考虑到neo 基因在转化细胞中的有效表达，neo 基因可以两种方式插入载体目的基因片段中：或者以一致的阅读匡插入目的基因片段中，或者在neo 基因翻译起始码5 上游引入翻译终止码。前者将在基因组靶位基因启动子驱动下，表达neo 基因的融合蛋白，使转化细胞具G418抗性〔7, 8〕，后者则通过核糖体重启动或翻译起始表达独立的neo 基因产物，转化细胞将同样获得G418抗性表型〔9, 10〕（图1, A）。
采用启动子缺失筛选方法，Charron〔8〕等定点突变了小鼠ES细胞N-myc基因，在G418抗性克隆中有高达20%的克隆来自同源重组。Schwartzberg等用启动子缺失方法成功筛选出ES细胞c-abl基因定点突变克隆〔7〕，通过胚胎嵌合体途径研制出基因定点突变小鼠〔11〕。
(2) Poly A缺失筛选方法: Poly A缺失筛选的载体设计与启动子缺失筛选类似，poly A缺失的正向选择基因neo 置于载体的目的基因片段中，neo 基因因缺失转录终止信号，其表达在转录水平受到抑制。在同源重组的细胞中，neo 基因利用基因组靶位基因的转录终止信号，得到有效表达，从而使靶细胞具G418抗性；非同源重组的细胞中，因neo 的转录障碍，不能有效产生G418抗性，由此实现同源重组转化细胞的富集筛选(图1, B)。
图1 正向筛选方法
A.启动子缺少筛选; B.Poly A缺少筛选。
Joyner等在鼠ES细胞En-2 基因的定点突变中采用上述方法，同源重组与非同源重组比率为1∶260〔5〕，比Thomas等〔2〕在Hprt基因定点突变中的比率提高了4倍。Zijlstra等〔12〕籍此方法获得高达1∶25的同源重组率，结合PCR筛选方法，得到β2-m基因定点突变的细胞克隆，进一步的实验证实，该突变通过嵌合体生殖性腺细胞转递给子代。
1.2.2 正负筛选方法 正负筛选方法是Capecchi实验室发展的基因靶位操作筛选系统〔13〕，这一系统同时适用于可选择标记基因和非选择性基因的靶位操作。正负筛选系统不受靶位基因功能和表达状况的影响，克服了正向筛选方法在这方面的局限。基因靶位操作载体采用置换型载体，正向选择基[1] [2] 下一页
上一个医学论文： 染色质结构与基因表达调控
下一个医学论文： 植物体细胞胚发生的分子基础
|
|
|
|
|
|
|
您现在的位置： 绿色健康网 >> 医学论文 >> 基础医学论文 >> 正文