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我国首次发现的HIV |
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条件为：94℃ 5 min 1个循环，94℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 120 s 30个循环，72℃ 10 min 1个循环。取部分PCR产物留作酶切鉴定。另取部分PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，以分子量标准物为参照，判断结果正确并拍照后切下特异性扩增产物，按Qiaex纯化试剂盒操作说明进行纯化。回收后的DNA片段溶于无菌去离子水中，经琼脂糖凝胶电泳估算其浓度。
1.4 扩增产物的酶切鉴定 混合8 μl PCR产物、3.5 μl H2O、1.5 μl HaeIII buffer、2 μl HaeIII，37℃水浴2 h后置8%聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，溴乙锭染色后观察并拍照。
表1 PCR及测序引物
Table 1 Primers used for PCR and sequence analysis
序号
Number 引物
Primer 用途
Usage 序列
Sequence (5 -3 )
1 O1 PCR AGAGGCTGGCAGATTGAGC
2 O2 PCR CAAGACGGAGTTTCTTGCG
3 I1 PCR，seq GAGGTTCTCTCCAGCACTAGCT
4 I2 PCR TAGGAGCACTCCGTCGTGGT
1.5 扩增产物的核酸序列测定 使用I1为测序引物，以提纯的PCR产物为模板，按操作说明进行循环反应。反应产物经沉淀纯化、变性后用ABI 377测序仪进行序列测定。
1.6 序列分析 经测定并校正后的序列发送到Genebank中按同源性大小查对，并从Genebank中获取14株HIV-2病毒基因组全序列，于扩增片段的相对位置调出其序列，应用Phylip软件包中的程序进行排列、比较等分析并作出进化系统树。
2 结果
2.1 PCR扩增 从套式PCR扩增后的结果可以看出，仅有HIV-2型病毒感染者的标本出现片段长约为330 bp条带，和预期的大小相符。而我省已有的HIV-1型病毒各亚型的标本均未出现该条带。结果见图1。说明该片段可能是HIV-2特异性扩增产物。
2.2 限制性内切酶鉴定 从HIV-2型病毒感染者的标本中扩增的片段经HaeIII酶切后分为两个片段，大小分别约为66 bp和264 bp。结果见图2。显示扩增片段中存在一个HaeIII酶切位点及其位置。通过对已报告序列的比较分析，该区确实含有一个HaeIII酶切位点，并且位置基本相同。实验结果与分析的情况一致。
图1 套式PCR扩增结果（长度单位：bp）
图2 HaeIII酶切图谱（长度单位：bp）
2.3 序列测定和比较分析 以I1为测序引物测定的片段序列（图3）在Genebank中查对的结果显示，与其亲缘最近的序列均为HIV-2序列，其同源性在90%～96%之间。另外和已报告的序列作排列比较也说明了同样的结果。这表明该扩增产物确系HIV-2病毒的特异性片段。而且就该片段的序列而言，系统树分析还表明，此株病毒和HIV-2UC1GNM株亲缘最近，与Genebank中查对的结果一致。
3 讨论
HIV-1与HIV-2抗体在血清学上存在一定程度的交叉反应，虽然我们通过多种血清学试验已确认该例感染者为HIV-2感染［1］，但进一步通过核酸分子生物学确认该病毒仍有必要。本研究从核酸特异性扩增、限制性片段长度多态性（RFLP）分析以及序列测定分析等方面进一步验证了血清学诊断的结果。目前，HIV-2的流行地区主要仍在西部非洲［3］，在亚洲地区已有印度、日本等国有HIV-2感染的报道［4］。此前我国尚无HIV-2的感染的报道。本例HIV-2感染者的发现，表明HIV-2已传入我国，由于该男子在入境后仍有嫖娼活动，因此，其在我省造成HIV-2的扩散是可能的。本研究序列分析的结果对今后HIV-2感染者传染源的追踪奠定了重要基础。
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