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人酪氨酸羟化酶基因在猴骨骼肌直接注射后的表达 |
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2.5ml/100cm2)，68℃下过夜。洗膜：(1)2×SSC，0.5%SDS，5min 2次；(2)0.1×SSC，0.5%SDS 15min 2次，68℃；(3)Washing buffer 1min,(4)bufferⅡ 30min。加碱性磷酸酶标记的羊抗地高辛抗体(用bufferⅡ1∶5 000稀释)振摇30min。buffer Ⅰ 15min 2次，bufferⅢ 15min。加显色底物氯化硝基因氮唑蓝(45μl)和5-嗅-4-氯-3-吲哚基磷酸二钠盐(35μl)(用10ml bufferⅢ稀释)，避光静置3～4h。buffer Ⅳ 5min后终止呈色反应。
图1 hTH RNA 探针合成线路图
Fig.1 The route of hTHRNA probe laleling.
结 果
1.pRcTH酶切后纯化得到4.3kb、1.8kb片段(图2，第2、3泳道)。pGEM 3zf酶切后纯化得到3.17kb片段(图2，第1泳道)。1.8kb及3.17kb片段连接后得到重组质粒pGEMTH，合成线路见图1，经BamHI/HindⅢ,KpnⅠ/XbaⅠ及XhoⅠ分别酶切，确定为正确插入(图3)。
2.地高辛标记hTH RNA探针经直接检测，与试剂盒中标准标记的RNA浓度基本相当(约1g/L),灵敏度达0.1μg/L(图4)。
3.猴肌及胎儿肾上腺组织的总RNA之OD260/OD280=1.99，根据OD260计算总RNA浓度：猴肌0.15g/L,胎儿肾上腺0.1g/L。各取3μl于1%甲醛凝胶电脉(30V，1.5h)，结果如图5。
4.Northern blot结果，猴肌及肾上腺均为阳性，说明在猴肌中有人TH基因的mRNA表达，且与肾上腺中的表达量基本相当(图6)。
图2 质粒pRcTH及pGEM酶切、纯化片段(1%凝胶电脉，50V，1.5h) M.λDNA/EcoRI,Hind Ⅲ 泳道1.pGEM经BamHI及Hind Ⅲ双酶切后纯化得到的3.17kb片段 泳道2.pRcTH经BamHI酶切后纯化得到4.3kb片段 泳道3. 4.3kb片段经HindⅢ酶切后纯化得到的1.8kb片段
图3 重组质粒pGEMTH酶切鉴定(1%凝胶电泳，50V，1h) M.λDNA/EcoRI，Hind Ⅲ 泳道1.pGEMTH/BamHI 泳道2.pGEMTH/KpnⅠ 泳道3.pGEMTH/XhoⅠ
图4 地高辛标记hTH RNA探针的直接检测 1.hTH RNA探针 2.control RNA探针(从左至右为1mg/L、100μg/L、10μg/L、1μg/L、0.1μg/L)
图5 猴肌及胎肾上腺组织总RNA电泳.泳道1.猴肌总RNA 泳道2.胎肾上腺总RNA
图6 Northern blot结果 M.猴肌 A.胎肾上腺
Fig.2 Purified fragment from pRcTH and pGEM after digestion (1% Agarose,50V,1.5h) M:λ DNA/EcoRI,HindⅢ;Lane 1:pGEM(3.17kb) digested by BamHI and HindⅢ;Lane 2: 4.3kb fragment from pRcTH digested by BamHI;Lane 3: 1.8kb fragment from 4.3kb fragment digested by HindⅢ.
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