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免疫应答中小鼠脾GAP |
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1 000)中4℃下孵育36～48h，特异性抗体由美国哈佛大学 Benowitz教授惠赠。孵育结束后，切片在TBS2T中洗30min,入TBS2T稀释的羊抗兔生物素化IgG(Sigma公司，1∶200)室温孵育120min,TBS2T洗(10min×3)，入TBS稀释的ABC复合物(Sigma公司，1∶200)室温孵育100min,TBS洗(5min×3)。切片进入含0.05%DAB，2.5%硫酸镍铵，0.01%H2O2的0.1mol/L,pH6.2醋酸缓冲液中呈色10～15min。贴片，必要时以1%中性红复染。室温晾干，100%酒精脱水、二甲苯透明，DPX封片。行空白对照实验。抗体的特异性检验采用吸收实验，详见文献［3］。
3.定量分析
对每例动物所有的脾切片逐张进行分析。在10倍显微镜下，从每张切片的左上角开始，向下移动视野，每隔4个视野取1个作分析用。为确保相邻上下扫描的视野没有重叠，两排之间相隔一视野的宽度。在Camera Lucida(Nikon,Japan)下，用统一粗细的笔画出白、红髓的轮廓和其中的阳性神经纤维。用Leica 570℃图像分析仪测定每个视野中白髓和红髓的面积和其中神经纤维的长度。计算出单位面积内神经纤维的总长度。
4.抗PPD特异性抗体的检测
采用间接ELISA法，其程序如下：进口ELISA板包被抗原(PPD 10mg/L)4℃过夜，1%BSA 37℃封闭1h，加入从1∶20开始稀释的免疫小鼠血清，37℃孵育1h，加HRP标记的羊抗鼠抗体(美国Sigma公司，1∶1 000)37℃，1h，四甲基联苯胺(TMB)呈色，2mol/L硫酸终止反应，ELISA读数仪(型号)检测结果。以上各反应步骤之间均以PBS Tween-20洗涤。
结 果
脾重测量结果显示免疫应答动物脾的重量明显高于对照组(P＜0.01)，除镜下发现生发中心增多以外，脾的一般结构未出现明显变化。
ELISA检测结果表明，血中抗PPD抗体滴度于初次免疫后第9d达到第1个高峰，追加免疫后第7d达到第2个且更高的高峰(图1)。
对照动物脾内GAP-43-LI神经纤维分布于中央动脉和其分支周围，同时有少数纤维伸入动脉周围淋巴鞘(PALS)的淋巴实质中，但一般只到达内层，偶见少数神经纤维分布于边缘区(图2a,2b)。在接近脾门的PALS中阳性神经纤维分布较密集。红髓中可见到少量细而短的GAP-43-LI纤维。大多数神经纤维上膨体较少。
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