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免疫应答中小鼠脾GAP |
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杨 宏* 王 凌 黄传书 鞠 躬
(第四军医大学神经科学研究所神经免疫调节研究室 西安 710032；
*军事医学科学院基础医学研究所神经生物学研究室，北京 100850)
摘 要 为了解脾交感神经在免疫功能增强时的形态变化，用免疫组织化学方法观察了BALB/c小鼠脾内生长相关蛋白样免疫反应(GAP-43-LI)性神经在结核菌素衍生蛋白(PPD)诱发的免疫反应高峰期数量和分布的变化。结果显示，动物在接受两次PPD注射(21d+7d)后，脾GAP-43-LI神经纤维密度明显增加并伴有分布和形态的变化。于对照动物，脾GAP-43-LI神经纤维主要分布于血管周围，少量伸入动脉周围淋巴鞘的脾基质中，而在免疫刺激的动物，不仅血管周围的神经纤维明显增多，动脉周围淋巴鞘外层、边缘区和红髓等免疫应答活跃的部位也出现许多神经纤维。神经纤维分支和纤维上膨体明显增多。以上结果提示：免疫应答中脾神经成分发生活跃的结构重塑，这些变化有可能与神经的免疫调节功能有关。
关键词 神经免疫调节 生长相关蛋白-43 脾 神经支配 小鼠
近年来的大量研究事实证明，神经、内分泌和免疫系统之间存在着相互影响和相互调节。免疫细胞产生的多种细胞因子可作为信使将免疫反应的信息传递给中枢神经系统，后者将信息整合后通过目前公认的神经内分泌和自主神经两大途径对免疫功能进行调节。初级和次级免疫器官的淋巴组织中神经纤维的发现为研究两大系统的功能联系开辟了广阔的视野。作为机体中神经系统与免疫系统直接接触的场所，脾的神经支配以及神经与脾免疫功能之间的关系得到了大量的研究。已知脾交感神经不仅仅是传统意义上的血管支配神经，它们在脾实质中也广泛分布；α、β肾上腺素受体及神经肽受体广泛存在于脾免疫细胞之上，并能介导相应激素对免疫细胞功能的影响；儿茶酚胺在体外、体内均能调节淋巴细胞的功能及去除交感神经支配对于脾的免疫功能产生极大影响［1，2］等事实证明，免疫器官的神经支配是神经免疫调节的重要途径之一。
以上多数工作是通过刺激或损毁交感神经来观察免疫功能改变的，而通过改变免疫状态来观察神经成分变化的研究很少。有报道老年大鼠脾交感神经的密度下降，间接表明神经支配密度与免疫功能的强弱成正比。而免疫功能增强的状态下脾交感神经密度有无改变尚未见报道。本实验中我们以生长相关蛋白(GAP-43)免疫反应作为脾交感神经纤维标记，研究在抗原刺激后抗体产生最高峰期BALB/c小鼠脾内神经的改变，借以了解脾神经在免疫功能增强时的可塑性，为深入探讨脾交感神经的免疫调节机理提供依据。
材料和方法
1.动物和实验处理
选7～8周龄，体重20～25g的雄性BALB/c小鼠18只，实验组和对照组各6只，另有6只用于探索免疫方案的前期实验。动物饲养在恒温、恒湿、定期消毒的环境中，饲以小鼠专用块食和清水。实验组动物接受2次免疫，抗原为结核菌素衍生蛋白PPD(中国药品生物制品鉴定所)。初次免疫时将抗原与福氏完全佐剂(Sigma公司)混合，每只动物腹腔注射500μl，含PPD 30μg。动物存活21d后接受第2次免疫注射，这次将抗原溶于消毒生理盐水，每只动物腹腔注射500μl，含抗原30μg。7d后将动物处死。对照组动物在相同的时间点接受2次消毒生理盐水腹腔注射，每只500μl,此实验方案根据前期实验组尾静脉取血、间接ELISA法测定血清中抗PPD特异性抗体的滴度而确定。在初次免疫后第9d有一抗体高峰，追加免疫后第7d出现第2个更高的峰(图1)。
2.组织处理和免疫组织化学
动物全部以1%戊巴比妥钠深麻(30mg/kg i.p.)，经主动脉灌注生理盐水10ml,继而灌注4℃的4%多聚甲醛-磷酸缓冲溶液10min。取出脾浸入相同固定液中后固定8～12h,称脾重，转入含20%蔗糖的磷酸缓冲液中4℃下浸泡12h。沿与脾长轴垂直的方向将脾分为4等份，取靠中线的一块自脾门向被膜方向做冰冻切片(厚30μm)，每5张切片中收集1张于0.01mol/L,pH7.4的磷酸钾盐缓冲液(KPBS)中。切片用甲醇+0.1%H2O2处理15min，以消除内源性过氧化物酶活性，0.05mol/L Tris-盐酸缓冲液(TBS)洗(5min×3)，浸入由TBS稀释的2%牛血清白蛋白(BSA)中封闭60min，直接进入由含2%BSA、1.8%叠氮钠、0.1% Tween-20 的双倍盐 Tris-盐酸缓冲液(TBS2T)稀释的特异性绵羊抗GAP-43 IgG(1∶[1] [2] 下一页
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