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面口部炎症刺激增强CGRP mRNA PPTAmRNA及NOS在大鼠三叉神经节中的表达 |
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和0.3% Triton X-100的0.1mol/L PB(pH8.0)中，37℃孵育约60min。经0.01 mol/L PBS冲洗后，切片裱于经明胶-铬明矾处理的载玻片上，置室温干燥，然后行原位杂交反应。
切片经0.1mol/L PB冲洗后，入杂交前处理液(含0.9%氯化钠、1.5%三乙醇胺和0.25%乙酸酐)，然后经系列酒清和氯仿脱水、脱脂。杂交时将200μl杂交液(含4×SSC，50%甲酰胺，0.025% tRNA，10%硫酸葡聚糖和10×Denhart液)，15μl DTT和标记探针［(6～9)×106dpm/载玻片］滴加到切片表面，40℃孵育48h。杂交后用1×SSC冲洗切片(55℃，3×20min)。经梯度酒精脱水后于室温中干燥，然后将Amersham LM-1 型乳胶(用蒸馏水1∶1稀释)涂在切片表面，置暗盒中4℃曝光。4周后，用D-19显影液和F-5坚膜定影液处理。水洗后进行脱水、透明、封片，光镜下明暗视野观察。
另用部分切片在行 NADPH-d组织化学反应时，反应液中不加β-NADPH或在行原位杂交反应时，将既含标记探针又含过量的未标记探针的杂交液孵育切片，结果为阴性。
4.观察、计数和数据处理
于各时间点对每只大鼠的切片用显微镜在明视野下计数阳性神经元的数量。阳性神经元胞浆表面银颗粒密度应高于背底5倍以上(即信/噪比＞5)。用Leica Q 500Mc图像分析仪对阳性结构的密度进行测定。对上述各组数据进行方差分析。
结 果
在对照组大鼠TG中，约有32.2%和16.2%的神经元被CGRP和PPTA探针标记(胞浆表面银颗粒密度大于背底5倍以上的神经元视为阳性神经元)。阳性神经元中大(直径≥40μm)、中(20～39μm)、小(直径≤19μm)神经元均有，但以中、小型神经元为主。CAR注射后，注射侧TG中CCRP mRNA 和PPTA mRNA 阳性神经元的数量分别达到了38.6%和22.8%，与未注射侧和对照组相比有明显差异，两侧的差异主要出现于刺激后6～24h。(图1～4，表1～3)。
图1，2 CGRP mRNA 在CAR 注射3d后的注射侧(5)和对照侧(6)TG中的表达
图3，4 PPTA mRNA 在CAR 注射3d后的注射侧(3)和对照侧(4)TG中的表达
Fig.1,2 Expression of CGRP mRNA in the TG on the contralateral side(1) and ipsilateral side(2) 3d after CAR injection.
Fig.3,4 Expression of PPTA mRNA in the TG on the contralateral side(3) and ipsilateral side(4)3d after CAR injection.
TG中NOS阳性神经元呈蓝黑色，NOS阳性产物充满于胞浆内。NOS阳性神经元约占TG神经元总数的10%，主要为中、小型神经元。给予CAR刺激后，刺激侧TG中NOS阳性神经元的数量较未刺激侧略有增多，达到14.2%，也主要表现于刺激后6～24h(图5，6；表1～3)。
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