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神经营养素在小鼠脾的定位研究 |
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杨 宏 伯 音 周长满* 鞠 躬** 范 明
(军事医学科学院基础医学研究所，北京 100850，*解放军北京医学高等专科学校解剖学教研室，
**第四军医大学神经科学研究所)
摘 要 为了解神经营养素与免疫系统的关系，用免疫组织化学方法对神经营养素包括神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养素3(NT-3)进行小鼠脾的定位研究。结果表明：3种神经营养素的免疫反应均存在于脾内，但分布特点各不相同。NGF主要分布于白髓动脉周围淋巴鞘(PALS)外层、边缘区(MZ)和红髓(RP)的巨噬细胞样和淋巴细胞样细胞；BDNF除具有与NGF相似的分布特点外，还见于脾淋巴小结生发中心的淋巴细胞样细胞；NT-3则存在于白、红髓的网状细胞样细胞。这一结果提示，脾的免疫和非免疫细胞均可能产生神经营养素，并提示不同类型的神经营养素对免疫系统有不同的作用。
关键词 神经营养素 脾 免疫组织化学 小鼠
神经系统的发育和存活依赖于神经营养性因子，即一类由神经元所支配的效应细胞或神经元自身所产生的蛋白质。先后发现的神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养素-3，4/5(NT-3,4/5)是一类在分子结构、受体类型、生物功能等方面相类似的因子，它们共同组成神经营养因子中的亚家族，合称神经营养素。
神经营养素除存在于神经系统之外，还广泛分布于全身其他器官并参与一些除神经营养之外的生理活动。有报道，NGF具有促进淋巴细胞增殖和分化［1，2］、调节T淋巴细胞白介素-2受体的表达等作用［3］。新近研究发现NGF、BDNF、NT-3/4等神经营养素mRNA存在于胸腺和脾［4］。因而，做为一种有可能在神经-免疫调节环路中起作用的因子，神经营养素正在引起人们的注意。但有关这些因子在免疫器官的定位尚不清楚。本研究应用免疫组织化学方法对以上3种神经营养素在脾内的定位进行初步研究，为揭示其在免疫系统的功能作用提供形态学基础。
材料和方法
1. 动物及组织处理
采用7～8周的雄性BALB/c小鼠15只，体重20～25g。动物以异戊巴比妥钠麻醉，经左心室灌注生理盐水10ml，继而灌注4℃的含4%多聚甲醛、0.01%戊二醛、0.2%苦味酸的磷酸缓冲液(0.1mol/L PB)，pH7.4。10min后取出脾，以不含戊二醛的上述固定液于4℃再固定12～16h。以与脾长轴垂直的方向将脾分为4等份，取靠中线的一块自脾门向被膜方向做振动切片(厚30μm)，收集所有切片于0.01mol/L的磷酸盐缓冲液(PBS)(pH7.4)中。
2. 免疫组织化学
特异性抗NGF、BDNF、NT-3多克隆抗体由美国Santa Cruz.公司提供(工作浓度1∶500)。染色中洗涤切片用0.01mol/L PBS(pH7.4)。切片先在0.01mol/L PBS中浸泡2～3h以去掉残留的固定剂，用甲醇+0.1%H2O2处理15min以消除内源性过氧化物酶活性，PBS洗(5min×3)，用0.01mol/L Tris缓冲液(TBS)稀释的正常羊血清封闭1h，直接进入由抗体稀释液(含1%牛血清白蛋白、0.2%TritonX-100、0.08%叠氮钠的0.01mol/L Tris缓冲液，pH7.4)稀释的特异性抗体中孵育36～72h。PBS洗(5min×3)，入羊抗兔生物素化IgG(丹麦Vector公司，1∶500)37℃孵育1～2h，PBS洗(5min×3)，入ABC复合物(丹麦Vector公司，1∶500)37℃孵育1h，PBS洗(5min×3)。切片经短暂过蒸馏水后进入含0.05%DAB、2.5%硫酸镍铵、0.01%H2O2的0.1mol/L醋酸缓冲液(pH6.2)中呈色10～15min。蒸馏水洗(15s×2).PBS与1%明胶混合液中贴片，部分切片以1%中性红复染。室温晾干，100%酒精脱水、二甲苯透明，树胶封片。
3. 对照实验
分别以PBS或正常兔血清替代一抗，以及以PBS替代二抗同步进行染色。
结果
1. NGF免疫反应性细胞的分布
NGF免疫反应性细胞主要分布于脾边缘区(MZ)和红髓(RP)，少数细胞散在于白髓动脉周围淋巴鞘(PALS)的外层或PALS与淋巴小结之间。而PALS内层和淋巴小结内几乎无阳性细胞(图1)。NGF免疫反应性细胞与血管关系密切，它们[1] [2] 下一页
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