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在发育过程中小鼠脑N |
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剂(enhanced chemiluminesence,ECL)温浴1min，印迹膜片用保鲜膜包裹，印迹面朝X线片曝光30～60s，经显影定影显现信号。X线片用UltroScan XL激光光密度仪分析。由于条带密度积分值与信号分子含量之间并不是线性关系，为了定量的准确性，实验引入经系列稀释的成年小鼠脑皮层组织作为样品的相对定量标准，范围为20～0.625μg/孔。该标准曲线数据适合下列非线性回归方程：
此公式中，a为最大值，b为斜率，c为折点值，d为最小值。通过这一标准可以把样品的密度积分信号转化为定量标准脑皮层组织的相对值，从而使样品之间受体亚单位量有直接的可比性。
结果
1. 定量免疫印迹标准曲线的建立
图1为成年小鼠大脑皮层组织与抗NMDA ε2的免疫印迹照片及由此结果数据化后建立的标准曲线。每孔加样量依次为0.625、1.25、2.5、5、10及20 μg。根据每个条带的密度积分值与相应的膜蛋白量作图。同理建立相应的抗ζ1和抗ε1免疫印迹的标准曲线，这些标准曲线分别用于相应的NMDA受体亚单位蛋白ζ1、ε1和ε2的定量。
图1 定量性免疫印迹标准曲线的建立
Fig.1 Standard curve constructed for quantitative immunoblot
图2 出生后不同天数小鼠前脑及小脑组织与
抗ζ1、抗ε1及抗ε2的免疫印迹
Fig.2 Immunoblots of forebrain and cerebellum tissues from mice of different postnatal days with anti-ζ1，anti-ε1 or anti-ε2,respectively.
2. 小鼠前脑及小脑组织与抗ζ1、抗ε1和抗ε2的免疫印迹
图3 新生小鼠发育过程中前脑及小脑组织NMDAξ1，ε1及ε2
亚单位蛋白的定量分析(*信号不能被密度仪读出)
Fig.3 Quantitative analysis of developmental expressions of NMDA ζ1，ε1 and ε2 subunit proteins of mouse forebrain and cerebellum(* under detectable)
图2是一组不同发育阶段(2～35d)小鼠前脑和小脑组织与NMDA受体亚单位抗体抗ζ1、抗ε1和抗ε2的免疫印迹结果。所有前脑组织的加样量为每孔4μg，小脑组织的加样量为每孔8μg，样本与定量标准的免疫印迹实验同时完成。每个年龄组共有5个不同的动物，因而共完成5组上述类似的实验。
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