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在发育过程中小鼠脑N |
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罗建红 朱丽君 郑 功 沈海清
(浙江医科大学医学分子生物学实验室，杭州 310031)
摘 要 为了测定新生小鼠发育过程中脑组织中NMDA受体亚单位蛋白的表达水平，用NMDA受体亚单位特异的抗体，通过引入成年小鼠皮层组织系列稀释的样品作标准，建立了定量的免疫印迹分析法。并对出生后不同日龄(2～35d)新生小鼠前脑和小脑组织中NMDA受体ζ1、ε1和ε2亚单位蛋白进行了测定。结果表明，ζ1、ε1和ε2三个亚单位在大鼠前脑组织中呈相似的增加趋势，只是ε1的表达明显的滞后。而小脑此3种亚单位的表达绝对量均明显低于前脑组织，并且趋势各不相同：ζ1经明显的下降后维持在一定的水平，ε1呈增加趋势，ε2出生后5d即有相当的表达，以后下降，3周后几乎不能测出。上述结果与相应的mRNA半定量分析结果基本一致，并且与大鼠同类研究结果大致吻合。
关键词 NMDA受体 亚单位 发育 免疫印迹 前脑 小脑
N-甲基-D-门冬氨酸(NMDA)受体在中枢神经系统突触的兴奋性传递中起重要作用，与许多重要的生理功能相关，如突触的可塑性、学习和记忆；同时也介入一些病理过程，如神经细胞兴奋性毒性作用、癫痫的发生以及慢性神经退行性变等。
NMDA受体属配基门控的离子通道，目前认为它是由两个家族的基因所编码的亚单位组成的异五聚体。大鼠的第1个基因家族命名为NR1，其小鼠的同源基因为ζ1，这一家族只有1个基因，但可以产生8个功能各异的剪接变体。第2个基因家族为NR2，共有4个相关的基因，即NR2A、NR2B、NR2C和NR2D，小鼠的同源基因分别为ε1、ε2、ε3和ε4［1～3］。在NMDA受体复合物中NR1是必需的成分，而由不同的NR2亚单位参与组成的NMDA受体通道则具有不同的电生理和药理学特征［2，3］。
研究表明，天然NMDA受体具有不同的功能亚型，决定这种功能多样性的重要基础正是亚单位组成的异质性。这与核酸杂交显示各亚单位的表达具有组织分布特异性及受发育调节的结果相一致［4，5］。我们及另几个研究小组则应用融合蛋白或多肽抗原制备NMDA受体亚单位特异性抗体，对NMDA受体亚单位蛋白的生化特征、组织学分布、发育性表达以及亚单位组成直接进行了研究［6～8］。本研究采用NMDA受体亚单位特异的抗体，对不同发育阶段小鼠脑组织的NMDA受体ζ1、ε1和ε2亚单位蛋白表达水平进行了测定。
材料和方法
1. 亚单位特异的抗体
本研究用的NMDA受体亚单位特异的抗ζ1单克隆抗体和抗ε2为自行研制［7］。抗ζ1由相当于NR1A1-561肽段的融合蛋白免疫产生，识别位点于341～561氨基酸顺序之间，能与所有的剪接变体反应。抗ε2则由相当于NR2B的C末端融合蛋白免疫产生。抗ε1免疫兔血清由相当于NR2A的C末端融合蛋白免疫产生(由美国Georgetown大学Wolfe博士惠赠)［8］。因为不同种属之间相应的亚单位蛋白高度同源，这3种抗体能特异地识别大鼠、小鼠、人等种属的同源亚单位［9，10］。
2. 小鼠脑组织细胞膜蛋白样品的制备
NIH种小鼠，断颈处死立即解剖取脑，分离出前脑、大脑皮层和小脑。置脑组织于湿重100倍量的预先冰冷的缓冲液A(10 mol/L Tris-HCl,pH7.4,320 mol/L蔗糖)中，用Kinematica组织匀浆器匀浆2次，每次10s，间隔20s，强度为50；700×g 4℃离心10min，把上清转移至另一离心管；低速离心的上清再经3 7000×g 4℃离心40min，弃上清，沉淀用缓冲液B(10mol/L Tris-acetate,mol/L EDTA,pH7.4)重新匀浆混悬。用Lowry法测定蛋白浓度，-70℃冷冻保藏。取样小鼠为出生后第2、5、8、11、14、21、28和35d共8个年龄组，每个年龄组为5～10个小鼠。
3. 十二酰基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹的定量分析
按常规的方法完成SDS-PAGE和分离蛋白的电转移，印迹膜片与上述一抗及HRP标记的二抗相继温浴后，经反复漂洗，与强化化学发光试[1] [2] 下一页
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