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人肺癌细胞中蛋白激酶C亚类与cAMP |
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激酶活性测定见文献［4，5］。收集细胞加入裂解液，超声破碎、离心，留取部分上清，测定PKA活性，反应管内含20mmol/L Tris*Cl pH7.5, 5mmol/L MgCl2， 50μg Histon(type Ⅲ)，1.5μmol/L cAMP与酶提取液。加入γ-32P-ATP，30℃反应3min，终止反应，点膜，液闪法测定。其余部分上清液通过DEAE-52纤维素柱，初步提纯和测定PKC活性，反应管内含25mmol/L Tris*Cl pH7.5, 5mmol/L MgCl2, 500μmol/L CaCl2, 50μg Histon (type Ⅲ); PS/DG 10μg/0.2μg与酶提取液，加入γ-32P-ATP, 30℃反应5min，终止反应，点膜，液闪法测定，同时测定总蛋白含量。
结 果
1.HMBA对人肺癌LTEPa-2细胞生长，cAMP水平及PKCα基因表达的影响
当用5μmol/L HMBA处理LTEPa-2细胞时，可见在处理的不同时间细胞增殖速度受到明显的抑制(图1)，并且在作用后的LTEPa-2细胞中cAMP含量明显升高(图2A)，同时与增殖密切相关的PKCα基因表达水平也显著下降(图2B)。
图1 HMBA(5μmol/L)处理对LTEPa-2细胞增殖的影响
■.LTEPa-2细胞
◆.LTEPa-2细胞+HMBA(5μmol/L)
Fig.2 The effect of HMBA (5μmol/L)treatment on proliferation of LTEPa-2 cells■.LTEPa-2 cells
◆.HMBA(5μmol/L)-treated LTEPa-2 cells
图2 HMBA(5μmol/L)处理3d对LTEPa-2细胞中
cAMP水平(A)与PKCα基因表达(B)的影响
A.cAMP水平 B.PKC α基因表达
a.LTEPa-2细胞 b.HMBA(5μmol/L)处理LTEPa-2细胞3d
(a)点印迹杂交结果 (b)点印迹杂交结果薄层扫描定量分析
Fig.2 The effect of HMBA (5μmol/L) treatment for 3 day on
cAMP level (A) and PKCα gene expression(B)
A.The level of cAMP B.The PKCα gene expression
a.LTEPa-2 cells b.HMBA(5μmol/L)-treated LTEPa-2 cells for 3 day
(a) Dot blot (b)Quantitative analysis of Dot blot by thin-layer scanning
2.PKC抑制剂Calphostin C对人肺癌LTEPa-2细胞中PKC活性和cAMP水平的影响
图3 Calphostin C(0.15mg/L)处理对LTEPa-2细胞增殖的影响
■.LTEPa-2细胞 ◆.Calphostin C(0.15mg/L)处理的LTEPa-2细胞
Fig.3 The effect of Calphostin C(0.15mg/L) treatment on proliferation of LTEPa-2 cells
■.LTEPa-2 cells ◆.Calphostin C(0.15 mg/L)-treated LTEPa-2 cells
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