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人肺癌细胞中蛋白激酶C亚类与cAMP |
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王向阳 柳惠图 胡云英
(北京师范大学生物系细胞增殖及调控生物学开放实验室，北京 100875)
摘 要 为了探讨蛋白激酶Cα(PKCα)及其与环腺苷酸-蛋白激酶A(cAMP-PKA)信号系统的相关性，用六甲撑双乙酰胺(hexamethylene bisacetamide, HMBA)和PKC 抑制剂 Calphostin C 分别处理人肺癌细胞LTEPa-2，统计细胞生长百分数，测定cAMP水平。用斑点杂交方法检测PKCα基因表达，并测定表达反义PKCα的人肺癌LTEPa-2细胞中PKC与PKA激酶活性。结果显示：5μmol/L HMBA处理人肺癌LTEPa-2细胞3d后，细胞增殖明显被阻抑，PKCα基因表达下降，cAMP水平升高。0.15mg/L PKC抑制剂Calphostin C导致人肺癌细胞增殖速度减慢时，cAMP水平也升高。在表达反义PKCα的人肺癌LTEPα-2细胞中，当PKCα基因和蛋白表达被阻抑、PKC活性明显降低的同时，PKA活性则显著升高。结果提示：在人肺癌细胞中PKCα亚类和cAMP-PKA通路显示出拮抗关系。PKCα和PKA两套信号系统相互作用，共同调节人肺癌细胞的增殖和转化。
关键词 细胞增殖 蛋白激酶Cα 环腺苷酸-蛋白激酶A 六甲撑双乙酰胺 蛋白激酶C抑制剂Calphostin C 人肺癌细胞
蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)和依赖于cAMP的蛋白激酶A(protein kinase A, PKA)作为真核细胞中两类主要的蛋白激酶系统，在细胞的增殖和转化中具有重要的调节作用［1］。cAMP-PKA信号通路和肌醇磷脂通路的作用本质与相关性决定于两者所控制的细胞系统；在一些内分泌组织、淋巴瘤细胞，PKC促进cAMP的形成，而在神经胶质瘤细胞、卵巢肉瘤细胞、血小板、嗜中性粒细胞，两套系统又表现出相互拮抗的作用。随着研究工作的深入，PKC家族成员的分子异质性使得PKC各亚类激活的信号传导途径和cAMP-PKA信号系统之间的关系也愈益被人们所关注。为此，我们以人肺癌细胞LTEPa-2为模型，探讨了PKCα亚类与cAMP-PKA信号系统间调节作用的相关性。
材料和方法
1.细胞培养
正常人胚肺细胞(2BS)、人肺癌细胞LTEPa-2及经药物处理的LTEPa-2细胞分别培养在含10%小牛血清的DMEM培养基中，于37℃和5%CO2培养箱中生长。
2.细胞生长曲线
细胞以1×104数接种在24孔板，24h后分别加入终浓度为5μmol/L六甲撑双乙酰胺(hexamethylene bisacetamide, HMBA)或0.15mg/L的PKC抑制剂Calphostin C于3个孔中，每天用计数器(coulter counter)计数，连续计数4d，以细胞数为纵坐标，处理时间(d)为横坐标绘制生长曲线。
3.RNA斑点杂交
3.1 RNA的提纯：收集LTEPa-2细胞及经HMBA处理的LTEPa-2细胞，用一步法［2］提取细胞总RNA，分装贮存于-70℃备用。
3.2 探针制备：PKC cDNA(2.28kb/Sall)：英国 Imperial Cancer foundation P.J.Parker 博士惠赠；探针标记采用随机引物标记试剂盒进行(美国 Promega 公司)。
3.3 RNA斑点杂交：基本按Thomas［3］方法，将硝酸纤维素膜浸泡于无RNase的水中后，转入10×SSC浸泡1h后待用。RNA样品用20×SSC梯度稀释后68℃变性15min，点样于膜上，室温晾干后，80℃真空烘烤2h。预杂交4～6h，加入α-32P标记的探针于42℃水浴中杂交18～22h，洗膜后在-70℃与X线胶片曝光，常规显影、定影。
4.cAMP 水平测定
收集细胞后加入5%三氯乙酸至1ml，混悬后放置30min，离心后留取上清，加入0.5ml 1mol/L HCl，加入2倍体积的饱和乙醚，反复抽提5次，然后用HClO4和KOH将溶液pH调至7.0。置70℃蒸干。cAMP含量测定依据试剂盒的说明程序进行(中国医学科学院基础所提供)。cAMP含量以pg/106细胞表示。
5.PKC和PKA活性测定
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