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rRTA DS27免疫毒素的制备及胞内运输研究 |
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PTG使终浓度达1 mmol
/L，诱导5h，12%SDS-PAGE分析全菌体蛋白。表达产物的免疫学鉴定，参照文献方法［5］进行。
1.2.2 表达产物的CM-Sepharose纯化30mlCM-Sepharose预先用5mmol/L pH6.5的磷酸缓冲液平衡，然后将表达产物的超声上清缓慢流过层析柱，不被CM-Sepharose吸附的杂蛋白用10倍柱体积的5 mmol/L pH6.5的磷酸缓冲液洗脱，然后用含有90 mmol/L NaCl的5 mmol/L pH6.5的磷酸缓冲液洗脱，收集洗脱峰，用12%SDS-PAGE分析。
1.2.3 免疫毒素的交联 使用异型双功能交联剂SPDP，交联方法参考文献［6］。交联液采用HP1050高效排阻液相色谱（HPSEC）进行分离。
1.2.4 双抗的胶体金标记5、15 nm胶体金颗粒由鞣酸法制备［7］。其中5nm胶体金颗粒标记兔抗ricin抗体，以示踪rRTA；15 nm胶体金标记羊抗鼠抗体，以示踪鼠抗人CD5单克隆抗体DS27。使用时将胶体金标双抗液以1∶20～1∶40倍比稀释。
1.2.5 细胞样品的准备 将HPSEC分离免疫毒素rRTA:DS27以10-9mol/L的浓度与胶体金标双抗、Molt4细胞共同孵育（对照组中不加免疫毒素），并于1、3、6、10四个时间点取样；所采集的细胞样品用无菌PBS（pH7.2）洗涤1次。
1.2.6 电镜样品的制备及观测将PBS洗涤的细胞沉淀，戊二醛和锇酸固定，丙酮、乙醇脱水，EPON 812包埋后，切成厚度约60nm的切片，Philip 400型透射电镜观测。
2 结果
2.1 rRTA的表达与鉴定 重组质粒pET3b-rRTA转化BL21(DE3)，IPTG诱导表达，SDS-PAGE分析全菌体蛋白。在相应于天然RTA链的位置，出现了明显的表达条带，表达水平占菌体总蛋白的约40%（图 1），Western blot证明了所表达的正是目的蛋白rRTA。
图1 SDS-PAGE分析rRTA的表达情况
Fig.1 SDS-PAGE analysis the expression of rRTA
Note:A.Wild type ricin；B.Uninduced pET3b/BL21(DE3)；C.Induced pET3b/BL21(DE3)；D-E. Uninduced pET3b-rRTA/BL21(DE3)；F-G.Induced pET3b-rRTA/BL21(DE3)
2.2 rRTA的CM-Sepharose纯化 表达产物的超声上清过CM-Sepharose柱，用含有90 mmol/L NaCl的5mmol/L pH6.5的磷酸缓冲液洗脱得到分子量约为30kD、电泳纯的重组蓖麻毒素A链（图2）。蛋白定量得知，重组蓖麻毒素A链的得率约为30mg/L 发酵液。这种纯化方法操作简单，只用CM-Sepharose一步就获得了电泳纯的重组蓖麻毒素A链。
图2 CM-Sepharose 纯化rRTA
Fig.2 rRTA purified by CM-Sepharose
Note:A. Wild type ricin;B. The sample before purification;C. The undesired proteins;D. Purified rRTA
2.3 免疫毒素的内化示踪 细胞与免疫毒素、金标双抗37℃培养0～1 h时，5、15 nm两种金标物都出现于细胞膜表面（图3），或其突起、凹陷等处。这些金标物在质膜上的分布并非均匀，大多数质膜表面未出现金标物，仅在质膜的少数区域观察到两种金粒的存在，这可能与Molt4细胞表面上CD5抗原的不规则分布有关。37℃培养1～3 h时，两种金标物都出现于有被小泡及一些大的胞内体中，有些金标物仍处于质膜表面，或出现于质膜的内陷小泡中，也有少数金标物出现于溶酶体中。37℃培养3～6 h时，在质膜表面几乎观察不到金标物的存在，金标物主要存在于各种形状的胞内体及溶酶体中（图4）。有些溶酶体内含有内化的运输泡，膜层结构非常复杂。37℃培养6～10 h时，在质膜表面及其附近的内吞小泡中都很难观察到金标物，绝大多数金标物出现于溶酶体中，某些含有双金标物的溶酶体临近高尔基器，但是在高尔基堆层内未能观察到金标物，可能是因为仅有极少数的金标物能进入高尔基器的缘故［8］。
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