|
甲基硝基亚硝胍处理的vero细胞中磷酸化蛋白的差异显示 |
| |
过细胞膜上的酪氨酸激酶激活，如丝裂原激活的蛋白激酶(mitogenactivated protein kinase, MAPK)［5］。
由于非定标性突变不是DNA直接受攻击的结果，那么在损伤部位到突变部位之间必然存在特定的联系。这种联系是否属于蛋白质磷酸化级联反应?是何种类型的磷酸化反应?我们试图通过比较甲基硝基亚硝胍(N-methyl-N’nitro－N-nitrosoguanidine, MNNG)处理和非处理细胞磷酸化蛋白的差异显示来初步回答这个问题。
材料与方法
(一)细胞分组：非洲绿猴肾vero细胞用含10%小牛血清的DMEM(Gibco)常规培养，实验时将细胞分为3组：
A组：MNNG(Fluka)处理组，0.2μmol/L MNNG处理2.5h；
B组：MNNG+Chm(cycloheximide, Sigma;蛋白质合成抑制剂)处理组，MNNG处理结束后，用含1 mg/L Chm的培养基继续处理12h；
C组：DMSO(二甲基亚砜，MNNG的溶剂)对照组，0.2% DMSO处理2.5h。
(二)细胞预处理和同位素预标记：3组细胞用全培养基培养24h，无磷酸盐的DMEM(Sigma)培养基作磷饥饿处理12h，在分别以含MNNG(A、B组)和DMSO(C组)的无磷培养基处理2.5h后，用含［32P］正磷酸盐(DupontTM,比活度3.7×1010Bq/mmol，放射强度3.7×1011Bq/L;在细胞培养基中的浓度为3.3μmol/L，放射强度为2.442×1010Bq／L)的无磷培养基预标记12h，其中B组培养基中同时含有1mg/L Chm。
(三)制备细胞蛋白样品：标记后的细胞用胰蛋白酶消化，将细胞悬液移于1.5mL Eppendorf管，用PBS清洗3次，吸净残液，每管加样品溶液(10% SDS，0.15mol/L DTT)30μL，煮沸5min，冷却后加120μL抑蛋白酶溶液，20μL DNase-RNase,混匀，室温放置5min，12000r/min，离心5min，上清液煮沸3min，冷却后上样电泳。
(四)蛋白质双向凝胶电泳：按Bio-Rad仪器说明书提供的方法配制等电聚焦凝胶柱，每种蛋白质样品上样30μL，连续电泳20h(电压200V 2h，500V 2h,800V 16h)后，将柱胶放置到12% SDS凝胶板上缘，在柱胶一端加5μL蛋白质分子量标准(Gibco,high range),25mA/板电泳1h，40mA/板电泳6.5h。
(五)蛋白质印迹电转移：电泳结束后，取下凝胶，用去离子水略事漂洗后将凝胶放入电转移夹，在LKB 2005 Transphor Electroblotting Unit上将凝胶蛋白转移至硝酸纤维素膜(NC膜)。电转移条件：电压50%，电流0.6～1.2Am,时间2.5h。
(六)压片、读片：NC膜用去离子水略漂洗后以保鲜膜封闭，放入暗盒，-70℃曝光12～36h后显影。
(七)蛋白质免疫印迹杂交(Western blotting):分别用购自Boehringer Mannheim公司的抗磷酸酪氨酸蛋白检测试剂盒(antiphosphotyrosine-POD,抗体1)和Immunotech公司的抗磷酸酪氨酸抗体(phosphotyrosine-KLH,抗体2)对差异显示的磷酸化蛋白进行Western blotting实验。抗体1操作按试剂盒说明书。NC膜在Stripping buffer中50℃缓摇1h，TBS洗膜10min×3次，封闭液室温处理1h，抗体1室温处理2h，TBS洗膜5min×6次，化学发光液反应60s，暗盒曝光5min；抗体2在膜用封闭液处理后室温温育2h，碱性磷酸酶酶联二抗处理1 h，继之生色反应。阳性对照(phosphotyrosine-BSA)试验均同步进行。
上一页 [1] [2]
上一个医学论文： Ang 对缺血缺氧性心肌胶原代谢的影响
下一个医学论文： 抗类风湿性关节炎54 kD和36 kD自身抗体在类风湿性关节炎诊断中的意义
|
|
|
|
|
|
|
您现在的位置： 绿色健康网 >> 医学论文 >> 基础医学论文 >> 正文