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造血生长因子促进RV介导LacZ NeoR基因在人骨髓造血细胞中转染的机制 |
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cells made by FCM with double staining of bromodexyuridine and propidium idodide demonstrated an highly proporation of hematopoietic cells in S phase after prestimulation with HGFs.［3H］－thymidine suicide tests of cultured hematopoietic progenitor cells also indicated increasing percentage of CFU-GM in S phase after prestimulation with HGFs.CONCLUSION： Prestimlation with SCF＋IL3＋IL6 combination could effectively promote the transfter efficiency of retroviral-mediated gene into human hematopoietic cells,which are associated with increased proporation of hematopoietic cells in S phase.
MeSH Human;Hematopoiesis;Retroviridae;Hematopoietic cell growth factors
人类造血干细胞(hematopoietic stem cell,HSC)的基因转染效率甚低已成为HSC用于基因治疗的最大障碍之一［1，2］。目前人们已采用高纯度的CD34＋造血细胞、造血细胞长期培养体系、腺病毒载体及HGFs的预处理等策略试图克服这一困境［3～5］。本研究探讨了SCF、IL3、IL6几种早期HGFs的联合预激改善RV介导的LacZ－NeoR双标志基因在人骨髓造血细胞中转染效率的可能性及其作用机制。
材料与方法
1.人骨髓细胞制备：取胸外科无血液疾患切除的肋骨，无菌下分出单个核细胞(MNC)备用。
2.包装细胞系及逆转录病毒载体BAG的来源与构建：pDOL是源于Moloney小鼠白血病病毒为基础的载体，将β－半乳糖苷酶LacZ基因克隆该载体后形成含有LacZ与Tn5新霉素耐药NeoR可选择的双标志基因的BAG逆转录病毒载体。LacZ位于NeoR的上游，两者的启动子分别是5′LTR和SV40。按常规方法转化、扩增提取质粒DNA。
3.BAG－PA317的产生及滴度测度：采用电转法将BAG质粒DNA首先转入嗜单向型Ψ2中，经G418压力选出BAG－Ψ2株，收集培养48h上清，在含有8mg/L硫酸渔精蛋白的条件下穿梭感染嗜双向型PA317包装细胞，尔后更换含600mg/L G418的D10培养基筛选，挑选并扩增BAG－PA317 G418R克隆。用常规感染NIH3T3细胞的方法测定其产假病毒滴度。收集产生高滴度的BAG－PA317上清，经0.45 μm滤膜过滤后用于转染造血细胞。
4.基因转染：转基因实验共分NABMC组和经IL3＋IL6、SCF＋IL3、SCF＋IL6及SCF＋IL3＋IL6预激48 h5组。转染条件为1×109／L的NABMC或HGFs预激后的NABMC、20%FCS－IMDM、BAG－PA317上清10mL、渔精蛋白8mg/L、SCF100ng＋IL3 100U＋IL6100U／mL。期间每8h更换新鲜体系。SCF、IL3及IL6分别为Amgen、德国Behrigwerke及荷兰TNO所惠赠。
5.FDG标记β－半乳糖苷酶的FCM检测：分取转染前及HGFs预激转染后的NABMC于37℃水浴5 min，加入100μL 2mmol/L FDG(Sigma)后轻震均，继续于37℃水浴1min后迅置冰浴上，加入1800 μL冰浴等渗培养液和1μmol/L碘化丙啶(PI)孵育60min，在FCM上检测，计算机收集分析数据。
6.［3H］－TdR自杀实验：分取NABMC和HGFs预激后的NABMC 2×108／L，加入7.4×104Bq甲基［3H］－TdR(18.5×1010Bq/mmol,Amersham)，对照组加入相同浓度的未标记脱氧胸苷TdR(Sigma)，37 ℃孵育1h后加入含未标记TdR 100mg/L的冷IMDM，中上一页 [1] [2] [3] 下一页
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