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大鼠脑缺血 再灌注损伤诱导IL 1 的表达 |
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in后松开动脉夹进行再灌。激光多普勒血流图像仪(LDIPIM1.0，瑞典)监测缺血前后软脑膜血流量。大鼠随机分为正常、缺血60min及再灌注2h、3h、6h、9h和12h共7个实验组。
(二)反转录－多聚酶链反应(RT－PCR）：常规提取脑组织RNA，RT－PCR反应按试剂盒(PROMAGE公司)说明进行。IL－1β［4］引物1：GACCTGCTTCTTTGAGGCTGAC,引物2：TTCATCTCGAAGCCTGCAGTG;GAPDH［5］引物1：ACCACCATGGAGAAGGCTGG,引物2：CGTAGGACCCGATGTGACTC。PCR反应条件94℃ 1 min、55℃ 1 min、72℃ 1 min，35个循环。反应产物内对照GAPDH528 bp及IL－1β 330 bp在1.6%琼脂糖凝胶电泳，图象处理系统(本院通用医学图象处理分析系统)对IL－1β及GAPDH条带灰度进行扫描，两者的灰度比率作为各组的半定量结果。
(三)IL－1多肽活性检测：96孔培养板每孔加小鼠胸腺细胞悬液100μL(6×106/mL)，1640培基50μL，大鼠脑组织匀浆液50μL，设阴性对照。37 ℃二氧化碳培养箱中孵育60h后加MTT(2g/L)50μL/孔，室温放置6h。离心后加DMSO 100μL/孔，分光光度计在492nm处读取OD值。
(四)浸润白细胞的观测：生理盐水经心脏灌注，4%多聚甲醛内固定脑组织后石蜡切片、HE染色、光镜观察。
MPO定量检测浸润到组织中的白细胞数。取正常、缺血及再灌12h组大鼠脑组织匀浆液加入0.5% HTAB(SIGMA公司)放置2min。离心取上清0.1mL加0.167g/L邻联茴香胺二盐酸化物(Sigma公司)和0.0005%过氧化氢混合液2.9mL。恒温紫外分光光度计在波长460nm处每隔15s连续记录OD值。MPO活性(U)定义为27 ℃单位时间(分)内OD值的变化。
(五)统计分析：所有数据均用平均值±标准差(±s)表示。个体前后资料进行自身对照t检验，两组间资料进行两均数t检验，多组资料进行方差分析。
结 果
(一)脑缺血－再灌注时脑血流的改变：脑顶部软脑膜血流量正常时左侧(4.64±0.50)V，右侧(5.40±1.12)V，缺血时左侧(1.88±1.20)V，右侧(3.07±0.29)V，两侧在缺血前后血流量均有下降(P＜0.01)。缺血时血流下降的百分比为左侧59%，右侧41%，左侧(引流侧)缺血明显P＜0.05。双侧血流于再灌注后恢复正常。
(二)IL－1β mRNA的表达：图1见IL－1β mRNA在正常及缺血脑组织表达较弱，再灌注2 h后表达明显升高。25例样品的灰度比率正常组为0.568±0.011、缺血组为0.603±0.023、再灌注组为1.076±0.015，再灌组与前两组相比P＜0.001，缺血组与正常组间无显著差异(P＞0.05)。
(三)IL－1多肽活性的改变：正常、缺血、再灌注3h、6h、9h和12h各组IL－1多肽活性(OD值／g)分别为23.10±2.13、23.78±4.51、33.73±3.16、36.40±2.38、34.48±2.51和32.04±2.41，缺血组与正常组间无显著性差异P＞0.05，再灌各组与缺血组相比P＜0.01(n＝40，图2)。
(四)白细胞的粘附和浸润：光镜观察见再灌9h后大量的中性粒细胞嵌塞缺血区微血管并浸润到周围脑组织中。组织MPO活性在正常、缺血及再灌12h时分别为(0.40±0.06)U／g、(0.45±0.10)U/g和(0.90±0.12)U/g，缺血组与正常间无显著差异(P＞0.05)，再灌组明显高于缺血和正常组(P＜0.01)。
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