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不同pH及封闭氨基端对甘氨酸拮抗内毒素作用的影响 |
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3 d，室温保持在(20±1)℃。
(二)试剂和仪器：精制大肠杆菌ET(E.coli O111:B4):上海生物制品研究所产品，批号940101， 800EU/安瓶；甘氨酸：上海生物制品研究所产品，AP；无热原生理盐水：暨南大学华侨医院制剂室；ST-1型数字温度计：上海医用仪表厂制造。
(三)实验方法：
1.配制不同pH的Gly、ET溶液：将ET(终浓度40EU/mL)和Gly(终浓度15%)共同溶解于NS中，测得溶液pH6.0；将这些溶液分成4份，用0.01mol/L HCl或NaOH分别将pH调整为4.0、6.0(原液)、7.4、10.0的溶液。另外单独用NS配制出ET溶液(浓度4×104EU／L)和Gly溶液(浓度15%)作为对照液。上述溶液均以1mL/kg剂量经耳缘静脉注射。
2.动物分组及处理条件：56只家兔随机分成7组，每组8只，分批实验，每批各组等数。7个组的注射物分别为：NS、Gly、ET、ET+Gly，pH值分别为10.0、7.4、6.0、4.0。每组注射剂量均为1 mL/kg，注射后记录体温变化。
3.体温测定：各组动物置实验架上，由肛门插入体温计探头，深10cm。待体温稳定后连续测结肠温度3次，每次间隔10min，取均数值作为基础体温。注射完毕记录结肠温度4h，观察其变化，绘制体温反应曲线，计算最大体温高度(ΔT℃)和体温反应指数(TRI4）。实验数据用±s表示，并用Student t检验判定均数差异显著性。
二、封闭Gly的氨基端对其拮抗ET作用的影响:
(一)试剂：N-甲酸苄脂甘氨酸(Cbz-Gly)：分子式为：
，其中氨基已被N-甲酸苄脂封闭，AP，美国Sigma公司产品；Gly:上海生物制品研究所产品；鲎试剂(TAL，每支用0.5 mL无热原水稀释)和ET工作标准品(10EU/支)，均为厦门鲎试剂厂产品。
(二)实验方法：Gly、Cbz-Gly、ET均用共同溶剂(20%乙醇)溶解。根据已做过的预实验结果：0.03 mol/L的Gly能明显拮抗2.5×103 EU／L的ET，以此用鲎试验方法进一步观察封闭Gly的氨基后对其拮抗ET作用的影响。
如下操作：
1号管：ET与TAL的反应。
2号管：ET和Gly(pH6.0)共同作用后，与TAL反应。
3号管：ET和Cbz-Gly共作用后，与TAL反应。
4号管：观察Gly对鲎试验反应有无影响。
5号管：观察Cbz-Gly对鲎试验反应有无影响。
6号管：为阴性对照，检测溶剂(体积分数为20%乙醇)对鲎试验的影响。每管重复20次，(以上各反应物用量均为0.1mL，ET浓度为2.5×103 EU／L，Gly和Cbz-Gly均为0.03mol/L)。
所有试管置37℃恒温水溶中静置60min，取出并在室温放置约5 min后，慢慢倾斜试管至180℃，观察结果［4］。
(三)结果判定：TAL与ET反应时，可观察到粘度和不透明度增加直至形成凝胶。
阳性(+)：表示形成坚实的固体凝胶或虽在翻转试管时，凝胶从管壁脱落，但仍为一实体。
阴性(-)：表示除阳性外的其它一切情况，如检品无变化，或虽有混浊、粘度增加等现象出现，但仍为液体、能流动者。
结 果
一、不同pH对Gly拮抗ET致热性的影响：
如表1、图1所示，注射不同pH的溶液后，家兔体温升高的幅度从高到低依次为：pH10.0组，pH7.4组、pH6.0组、pH4.0组。这4组间两两比较ΔT和TRI4.0：pH10.0组与pH7.4组相比(P＜0.05)，与pH6.0组相比(P＜0.01)、与pH4.0组相比(P＜0.01)；pH7.4组与pH6.0组相比(P＜0.05)、与pH4.0组相比(P＜0.01)；pH6.0组与pH4.0相比(P＜0.05)，均有显著或非常显著差异。ET组与NS对照组有非常显著差异（P＜0.01)，与pH4.0组有非常显著差异(P＜0.01)，与pH6.0组及pH7.4组也有显著差异（P＜0.05)，但与pH10.0组相比无显著差异(P＞0.05)。Gly与NS组相比无显著差异(P＞0.05)。
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