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豚鼠延髓c |
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mpL39)，-20℃贮存备用。
三、OmpL39免疫保护力检定试验：
(一)实验动物：健康荷兰种一级豚鼠18只，体重120～200g，在实验条件下先驯养1周备用。
(二)免疫力试验：1.动物分组：将18只健康豚鼠，按随机化原则分为3组，分别为OmpL39组(实验组)，钩端螺旋体菌苗(whole leptospira cell vaccine,WLCV)组(阳性对照组)，NS组(阴性对照组)。2.免疫方法：腹股沟内侧及腹壁皮下多点注射，以氢氧化铝为佐剂，聚丙烯酰胺为辅助佐剂。3.免疫时间：分两次免疫。第一次于实验当天开始，第二次于实验开始后第7 d。于第二次免疫后10 d，抽心血做MAT检查。4.攻击：于第二次免疫后15d用强毒017株钩体1×1012条/L×2 mL皮下攻击免疫豚鼠。
四、免疫力判定标准：
参照卫生部颁发的《中国生物制品规程》第一部检定钩体疫苗规程要求［3］，测定抗体效价，统计豚鼠生存率，内脏出血程度等情况判定免疫力合格与否。
合格：如攻击后10 d实验组3只豚鼠健存，阴性对照组豚鼠至少有2／3的豚鼠患钩体病死亡(患病率＞66%)，判为合格，否则为不合格。
五、豚鼠延髓c-fos表达的检测：
参照Bullitt E等的方法［5，6］，经改进进行。活菌攻击后第8 d抽心血处死动物，取新鲜延髓冰冻切片用免疫组织化学ABC法显色。用珞明胶将切片贴于载玻片上，晾干，酒精梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。
各组随机选一切片于荧光高倍显微镜下照象(1×400)。每片取四角及中心，共5个视场，计算每个视场中c-fos表达颗粒所占面积与此整个视场面积的比，此5个面积比的平均数，即作为该组豚鼠延髓切片的c-fos表达颗粒面积比。c-fos表达颗粒(FLI)(个)计数方法同上。
六、统计学处理方法：
用单因素方差分析q检验法检验所得数据，数据以均数加减标准差(±s)表示。
结 果
一、TX-114抽提钩体各分离层的SDS-PAGE电泳图比较：
问号状钩体017株经TX－114处理，分为3个相层，原生质相层、水相层、TX-114纯化相层。原生质蛋白带最多(20余条)，水相层条带也多(10余条)，带区复杂。TX-114层疏水外膜蛋白在66×103～16×103间仅有5条主要蛋白区带，其分子量分别为66×103,39×103,35×103,27×103和16×103。各区带间隔宽，主次带清晰、锐利，便于区别辨认和分离、纯化(见图1)。
二、纯化赖型017株钩体OmpL39的SDS-PAGE电泳图谱：
用制备电泳分离017钩体疏水外膜蛋白，切下39×103区带，经洗脱回收并SDS-PAGE电泳，可见39×103蛋白清晰带(见图2)。
三、OmpL39免疫力试验结果：
用OmpL39免疫，结果OmpL39可使豚鼠产生高效价阳性抗体(MAT 1：＞3200)，OmpL39组6只豚鼠均健存，无黄疸，解剖无肺及皮下出血，判定免疫力合格；死菌苗组6只豚鼠均健存，MAT 1∶＞1600，免疫力合格；生理盐水组6只豚鼠均死亡，死亡率为100%，无免疫力。
四、c-fos基因表达颗粒图象：
在高倍镜下，可见OmpL39免疫组c-fos颗粒极少，颜色浅，多呈浅棕色，在细胞核中较多；死菌苗组颗粒稍多，呈浅棕褐色；细胞质中较多；而阴性对照组c-fos颗粒多、颜色深，呈棕褐色，在细胞中较均匀分布，可清楚分辨细胞形态和轮廓(见图3A～C)。
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