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重组EB病毒BHRF1蛋白对裸鼠脾细胞程序性死亡的抑制作用 |
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基因序列［4］用PCR方法获得了EBV的BHRF1全基因片段(592bp)，克隆于pBV 221载体，并获得原核表达产物重组EBV-BHRF1蛋白质(rBHRF1)［5］。本研究观察该rBHRF1提取液对地塞米松(dexamethasone, DEX)、43℃加热及无小牛血清培养所诱导的裸鼠脾细胞凋亡的影响。
材料与方法
(一)实验材料：1.实验动物：6周龄的BALB/c系裸鼠，共18只(每次6只，重复2次实验)，雌雄兼用，购于本校实验动物中心，在该中心无特殊病原体(specific-pathogen free, SPF)条件下喂养。2.DEX.为Sigma公司产品。3.RPMI-1640培养液，购于Gene公司。
(二)实验方法：1.无菌取脾，按常规方法制备脾细胞，细胞终浓度为3×106个/mL，经台盼蓝染色检查，死细胞小于5%，分成3组(各分实验组和对照组)备用。2.实验组加入重组蛋白抽提液(终浓度为2mg/L)，而对照组加入不含BHRF1片段的空白质粒转化的菌体抽提液。在37℃，体积分数为5% CO2培养8h后，第一组加1×10-6mol/L地塞米松作用，继续培养18h［6］；第二组在43℃作用10min；第三组在无小牛血清培养液中继续培养48h，常规方法收集各组细胞。3.DNA裂解片段抽提方法及常规透射电镜检测参见朱振宇等［6］及潘景轩等［7］方法。
结 果
(一)裸鼠脾细胞PCD模型的建立：在10-6mol/L地塞米松作用18h、43℃加热10min及无血清培养48h等方法处理后，抽提细胞DNA，经琼脂糖凝胶电泳显示均出现PCD特征性的梯形(ladder)DNA降解片段，片段大小为180bp或其整倍数(见图1)。常规透射电镜下观察，细胞核凝缩，细胞膜及线粒体膜等结构基本保持完整，但未见有凋亡小体出现(见图2A)。而加入rBHRF1的细胞结构则基本保持正常(见图2B)。
(二)rBHRF1对裸鼠脾细胞PCD的影响：实验组因有rBHRF1的保护，其DNA降解片段明显少于各对照组(图3)，也很少出现上述PCD形态学变化。初步表明rBHRF1提取液对DEX、43℃加热及无血清培养等多种因素所诱导的裸鼠脾细胞PCD具有明显的抑制作用。
讨 论
细胞凋亡和坏死是细胞死亡的两种方式。与细胞坏死不同，细胞凋亡的主要特征是核固缩和染色质的有控降解，它是正常组织清除对机体无益细胞的一种主要方式，无论在生物个体生长发育过程中，还是在保持机体正常组织的平衡、稳定方面均具有重要作用［8］。机体内的细胞凋亡受抑或过度均可导致一系列疾病的发生，有效调控细胞凋亡已成为临床治疗的目标之一［1］。已证实Bcl-2基因产物能拮抗多种因素所引起的PCD，处在PCD基因调控的中心位置［3］。EBV-BHRF1基因与Bcl-2有38%同源性，其表达产物在细胞中的定位也相同，有人推测它与Bcl-2蛋白质一样具有拮抗多种因素引起的细胞凋亡作用［2］。本研究结果显示，EBV-BHRF1全基因的原核表达产物rBHRF1在终浓度为2mg/L，预培养48h，具有抑制1×10-6mol/L DEX作用18h、43℃加热10min及无血清培养48h所诱导的裸鼠脾细胞程序性死亡的作用。rBHRF1拮抗上述因素所诱导的PCD的具体机制尚不明确，其作用的时效、量效关系及其抑制PCD的作用是否具有普遍性等问题均有待于将该重组蛋白纯化后进一步的研究来确定。纯化定量后rBHRF1有望用于临床上多种因PCD过度所引起的疾病如早老性痴呆(Alzheimer s disease)、帕金森氏病(Parkinson s disease)和再生障碍性贫血(aplastic anemia)等的治疗。
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