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谷氨酰胺对缺氧复氧损伤人小肠上皮细胞谷胱甘肽的影响 |
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,OFR直接和多聚不饱和脂肪酸作用导致细胞膜脂质过氧化和细胞死亡［1］。还原型谷胱甘肽(reduced glutathione, GSH)是机体抗OFR损伤的重要物质。谷氨酰胺(glutamine, GLN)是合成GSH的必需物质，肠上皮通过代谢GLN生成大量合成GSH的前体物质谷氨酸，因此，GLN可能是通过维持细胞内GSH水平而发挥细胞保护作用。本实验采用原代培养人胎小肠上皮细胞(intestinal epithelial cell, IEC),观察GLN对缺氧复氧(anoxia/reoxygenation, A/R)损伤人IEC细胞内GSH水平和细胞膜脂质过氧化的影响。
材料和方法
一、材料：
1.试剂和药品：粗胶原酶Ⅺ型、胰蛋白酶、表皮生长因子、胰岛素、肝素、山梨醇、邻苯二甲醛(o-phthaladehyde, OPT)等为Sigma产品，Dulbecco改良Eagle氏培养基、胎牛血清、谷胺酰胺(glutamine, GLN)为Gibco产品，中性蛋白酶Ⅰ型(Boehringer mannheim,德国)，青霉素(上海第二制药厂)，链霉素(上海第三制药厂)，硫代巴比妥酸、1，1，3，3-四甲氧基丙烷均为Fluka AG Buchs公司产品。
2.实验仪器：Queue细胞培养箱(Queun Systems, USA)，RF-540型荧光分光光度计(日本)。
二、方法：
1.IEC细胞培养：采用本实验室建立的人胎IEC分离培养方法［2］。
2.缺氧复氧模型的复制：取原代培养d 10， IEC，以质量分数为0.25%胰蛋白酶消化，离心洗涤去胰蛋白酶，细胞用新鲜培养液稀释为2×109/L。台盼蓝染色细胞存活率为98%。再种植在24孔板中，每孔1 mL细胞悬液。按文献方法造成IEC缺氧复氧损伤［3］。即吸去24孔内90%培养液，以减少气体弥散距离，剩余培养液能维持细胞存活。将之置入一密闭容器中，负压抽吸其中空气，换入纯氮气，密闭后置入培养箱中培养60min或90 min(缺氧)，再取出24孔板，加培养液至原含量，将之置入培养箱中培养30min(复氧)。对照组细胞直接置培养箱中培养，培养箱条件均为37℃、体积分数为95% O2、5%CO2。
3.实验分组：实验设正常对照组、缺氧60min复氧30min损伤组(简称A/R 60min)、缺氧90min复氧30min损伤组(A/R 90min)，其中各组又设生理盐水(NS)对照组和GLN处理组，每组4孔。各组在缺氧复氧损伤前分别加入GLN (2mmol/L)或等量生理盐水。
4.GSH含量测定：取0.5mL细胞悬液，用荧光法测定IEC细胞内GSH含量，参考沈惠麒等方法略加修改［4］。
5.MDA含量测定：TBA荧光法［5］，测定条件λex=515nm,λem=550nm。
6.统计分析：实验数据均以±s表示，组间差异比较采用双侧t检验(a=0.05)。
结 果
(一)结果见表1。在培养液中加入2 mmol/L GLN对无缺氧复氧损伤IEC细胞GSH含量无影响。缺氧60 min复氧30 min后IEC细胞内GSH含量显著低于无缺氧复氧损伤IEC细胞GSH含量，GLN处理组GSH含量显著高于缺氧复氧组。缺氧90 min复氧30 min后IEC细胞内GSH含量进一步下降，但加入GLN组GSH含量显著高于缺氧复氧组。
表1 GLN对缺氧复氧损伤IEC细胞GSH的影响
Tab 1 Effects of GLN on intracellular GSH in human IEC with
anoxia/reoxygenation (μg/106 cells, ±s,n=4)
Control group A/R group
A/R 60 min A/R 90 min
NS 10.64±2.08 7.01±1.29▲ 6.10±1.09▲
GLN 10.68±2.24 8.55±1.32 8.12±1.23
▲P＜0.05，vs control group
(二)缺氧60min复氧30min后IEC细胞内MDA含量显著高于对照组(1.41±0.12 vs 1.08&plu上一页 [1] [2] [3] 下一页
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