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快速高效的DNA连接 |
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陈严 汤敏谦
Rapid and Efficient DNA Ligation
CHEN Yan TANG Min-Qian
(TaKaRa Biotechnology (Dalian) Co., LTD.Dalian116600)
DNA片段的连接在基因操作过程中应用广泛。通常情况下利用T4 DNA Ligase 必须经过长达16小时才能完成连接反应, 而且反应常常受到DNA末端结构等的影响。
宝生物工程(大连)有限公司(TaKaRa)的DNA连接系统(TaKaRa DNA Ligation Kit Ver.2) 由于其独特的反应液体系, 可以将反应时间缩短至半个小时, 且不受DNA结构等的影响, 大大地节省了反应时间, 方便了实验操作。此外, 在使用本试剂盒时, 由于只需简单地向DNA溶液中加入一种溶液, 可以在极小的反应体积下, 短时间内高效地完成各种形式的DNA连接(图1、2)。并且反应液可以直接用于感受态细胞的转化和体外包装等。
图1 DNA Ligation Kit Ver.2 的使用方法
图2 DNA Ligation Kit Ver.2 和T4 DNA Ligase 的连接效率比较
1 试剂盒内容(50 次量)
Solution I (酶溶液)250μl×3;Solution Ⅱ (缓冲液)750μl×1。
2 向pUC118-EcoRI分解物中插入DNA片段(环状DNA的连接)
含有pUC118/EcoRI Fragment (50ng) 及1.5KbpEcoRI Fragment (2.5～250ngg)的DNA溶液共5μl, 加入等量的Solution I 溶液(5μl), 混合均匀后, 在16℃下反应30分钟, 取反应液的一部分转化至JM109感受态细胞后在含有X-Gal、IPTG及Amp的L-琼脂平板培养基上涂板生长, 形成单菌落, 计数白色菌落(表1)。同时以通常使用T4 DNA Ligase (350U), 在16℃下进行16小时的连接反应作对照。在本实验中所使用的JM109感受态细胞的转化效率为6.3×107 Colonies/μg pUC18 DNA。结果表明, 使用DNA Ligation Kit Ver.2时的连接效率比使用T4 DNA Ligase 时的连接效率高。
表1 环状DNA在使用Ligation Kit Ver.2和T4 DNA Ligase时的连接效率比较
插入DNA／载体摩尔数比 DNA Ligation Kit Ver.2(反应30min) T4 DNA Ligase(反应16hr)
脱磷酸载体 非脱磷酸载体 脱磷酸载体 非脱磷酸载体
0.1 1.7×106 7.8×105 1.6×105 4.6×105
0.3 5.0×106 2.5×106 2.0×105 1.0×106
1.0 1.7×107 8.2×106 1.8×106 1.9×106
3. 2.3×107 1.7×107 3.1×106 5.0×106
10.0 2.1×107 2.3×107 1.9×106 1.2×107
pUC118/EcoRI 载体使用了脱磷酸载体与非脱磷酸载体两种, 对此同时分别作出了比较。
表中的数字为白色菌落数/μg Insert DNA。
3 向噬菌体臂λgt11/EcoRI中插入pBR322/EcoRI分解物(线形DNA的连接)
含噬菌体臂λgt11/EcoRI (脱磷酸化)250ng及pBR322/EcoRI 25ng 的DNA溶液共5μl, 加入与DNA等量的Solution Ⅱ(5μl), 均匀混合。然后加入DNA溶液2倍量的Solution I (10μl), 在26℃下反应10分钟。取20&m[1] [2] 下一页
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