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等温核酸序列扩增检测不同临床阶段的HIV |
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station or prognoses, and worth of further study.
Key words： HIV-1 infection; Viral load; NASBA
90年代初以来，定量测定人免疫缺陷病毒（HIV-1）感染者体内HIV-1 RNA含量的病毒载量测定方法日趋完善。研究表明，HIV-1病毒载量已经成为评价HIV感染者的病程、预测临床进展以及评价抗HIV药物的疗效等方面重要的实验室指标［1，2］。为了解我省不同临床阶段HIV感染者血浆HIV-1 RNA水平，本文随访观察我省无症状HIV感染者和有艾滋病关综合征/艾滋病的病人8例，采集外周血标本9份，应用分子生物学等温核酸序列扩增技术（Nucleic Acid Sequence-Base Amplification, NASBA）测定其血浆HIV-1 RNA的载量（Viral Load, VL），初步探讨我省不同临床阶段HIV感染者血浆VL水平，以及其与患者临床表现、预后之间潜在的关系。
1 研究对象及方法
1.1 研究对象 1992～1999年间我省艾滋病监测中心发现、确认的部分HIV抗体阳性者8例。在血样采集之前，详细询问病史。根据我国HIV/AIDS诊断及处理原则(国家标准1995)，把他们分为无症状的HIV感染者(病例组Ⅰ)及有艾滋病相关综合征/艾滋病的病人(病例组Ⅱ)各4例，两组的平均年龄分别为28.3岁±2.5岁和31.0岁±1.6岁。
1.2 标本的采集及测定
1.2.1 标本采集： 静脉采血5 ml，用EDTAK3抗凝，在3 h内，1 000 g离心10～20 min。分离血浆于灭菌、螺口的塑料离心管中，置-30℃保存，待测。
1.2.2 HIV-1 RNA病毒载量的测定： 采用NASBA HIV-1 RNA QT法检测(试剂盒为Organon Teknika产品)，操作按说明书进行。①核酸的提取：取100 μl待测血浆、适量的3种内标RNA（Qa、Qb、Qc），加入900 μl硫氰酸胍（GuSCN）裂解液及50 μl的硅石颗粒，以吸附所有的核酸。以含GuSCN缓冲液、70%乙醇及丙酮依次洗涤硅石颗粒。待硅石颗粒干燥后，加入50 μl的洗脱缓冲液，洗脱下吸附的核酸；②核酸扩增：取5 μl的核酸提取液于扩增管中，加入5 μl的引物混合液，依次于65℃温育5 min、41℃温育5 min，然后加入5 μl的三酶混合液，继续在41℃温育90 min；③测定及计算：取上述扩增产物5 μl，作适当稀释。另取4支试管，各加入5 μl稀释的扩增产物、10 μl磁珠溶液（内含能结合所有扩增产物HIV-1、Qa、Qb、Qc的通用探针），然后分别加入带钌标记的特异探针（各针对HIV-1、Qa、Qb、Qc）。置41℃杂交30 min后，加入300 μl的检测缓冲液，用NASBA QR System 电化学发光反应（ECL）检测仪检测ECL的信号。根据4种扩增产物光信号的比率即可计算出血浆中HIV-1 RNA的起始量，以lg/ml表示。
1.3 数据的统计分析 本研究的数据采用统计软件EPI 6.0进行录入和分析，结果以均数标准差（±s）表示，各组均数间行t检验。
2 结果
2.1 病毒载量(VL) 不论HIV感染者目前的临床阶段如何，8例病人的9份血浆标本全部HIV-1 RNA阳性，敏感性达100%。比较病例组Ⅰ与病例组Ⅱ的VL，结果有非常显著的差异（P<0.001），见表1。其中1例无症状HIV感染者在随访期间有临床进展，出现艾滋病相关综合征，采第2份血样（间隔6个月）。第1份和第2份血浆的VL分别为6 000个/ml（3.778 lg/ml）和34 000个/ml（4.531 lg/ml），相差0.753 lg ，而病例组Ⅱ为出现艾滋病相关综合征或艾滋病的HIV感染者。
2.2 病毒载量与临床预后之间的关系 6个月后，再次随访曾进行病毒载量检测的8例HIV感染者，发现其中已有3例因艾滋病或艾滋病相关病症死亡，存活者与死亡者的年龄分别为29.0岁±2.5岁和31.0岁±2.0岁，比较他们6个月前的病毒载量存在差异，见表2。
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