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CR用于诊断人类埃立克体病方法的建立 |
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Reaction; Ehrlichia chaffeensis; Human Monocytic Ehrlichiosis; Human Ehrlichiosis (HE)
自从1987年首次在美国发现人类感染埃立克体以来，许多研究机构对人类埃立克体感染进行了广泛研究。目前，世界上已发现3种人类埃立克体病，其中查菲埃立克体（Ehrlichia chaffeensis）是人类单核细胞性埃立克体病(Human Monocytic Ehrlichiosis, HME)的病原体［1］。该病患者主要表现为发热、头痛、肌痛、意识不清、低氧血症和血小板减少等症状。人类单核细胞性埃立克体病大多经历为一个缓和到严重的过程，由于其症状不典型及缺乏诊断试剂，常导致临床上的误诊和漏诊，延误病人的治疗时机。本文采用PCR方法检测犬巨噬细胞(DH82细胞)内的查菲埃立克体，利于人类单核细胞性埃立克体病的早期临床诊断。现将结果报告如下。
1 材料和方法
1.1 DH82细胞实验感染查菲埃立克体 将冻存于-80℃的查菲埃立克体（91HE17）分离株（美国Walker实验室于学杰博士惠赠）置于37℃解冻，无菌法吸出，加入已长满单层DH82细胞（军事医学科学院陈香蕊研究员惠赠）的25 cm2培养瓶中，并加入适当体积培养基，放置于37℃培养箱培养1.5 h。然后将培养瓶中液体吸出，加入4 ml新鲜MEM培养基，其含1% L-谷氨酰胺、100 U双抗（青霉素和链霉素）、10%新生牛血清，置37℃的培养箱中培养，每隔3天换培养液1次。感染40天后收集细胞进行PCR检测。
1.2 PCR扩增引物的选择 根据Anderson等［2］研究从已测序的查菲埃立克体16S rRNA基因序列设计一对引物。引物HE1序列为 （5′-CAATTGCTTATAACCTTTTGGTTATAAAT-3′），它与查菲埃立克体16S rRNA基因序列5′末端一个可变区内的基因序列相一致，第2个引物HE3序列为（5′-TATAGGTACCGTCATTATCTTCCCTAT-3′），它是根据查菲埃立克体16S rRNA的保守区来构建。利用这一对引物可以扩增出查菲埃立克体特异性的389 bp核酸片段。
1.3 查菲埃立克体DNA的提取 将查菲埃立克体感染的DH82细胞和裂解液（含1% SDS、100 ng/ml ProteinaseK）混匀，置50℃恒温水浴2 h后用等体积的酚氯仿抽提两次，12 000 r/min 4℃ 离心10 min，取上清，用2倍体积无水乙醇于-20℃沉淀1 h，12 000 r/min 4℃ 离心10 min,弃去上清，用70%乙醇洗涤沉淀1次,将DNA放置室温干燥，用亚沸水悬浮，作为PCR扩增的模板。
1.4 PCR扩增 PCR反应总体积为30 μl。取5 μl查菲埃立克体DNA，其它反应产物10×buffer 3 μl 2.5 mmol dNTP 2.4 μl Primer 30 pmol Taq DNA聚合酶3 U。扩增系数如下：94℃变性1 min，55℃煺火2 min，70℃延伸1.5 min,重复3个循环。接着,88℃变性1 min,55℃煺火2 min,70℃延伸1.5 min,重复37个循环。反应中同时设立阳性和阴性对照。
1.5 PCR扩增产物的鉴定 PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，紫外线透射仪显影后，阳性标本进行5% PAGE电泳分析，并用PGEM－3Z(+)/HaeⅢ DNA Marker作为核酸分子量参照物。同时对扩增产物进行限制性片段长度多态性（RFLP）分析［3］，进一步证实扩增产物的特异性。
2 结果
2.1 感染的DH82细胞的细胞病变（CPE） 感染查菲埃立克体（91HE17）的DH82细胞与正常的DH82细胞相比较，其胞浆中出现了一些大小及数量不等的空泡，而且细胞似乎要从培养瓶的瓶壁上脱落下来。细胞坏死后形成病灶，病灶周围的细胞形态不规则，或小，或圆，或有细黑树突状的突起。随着CPE加剧，病灶不断扩大，形成空斑，空斑中可见坏死的细胞及细胞碎片，但出现上述异常改变的细胞数量并不多见。
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