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脊髓混合性胶质细胞机械损伤后的形态变化 |
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ne of the cells were GFAP positive.Some of the cells were GC positive indicating that they were oligodendrocytes.But they comprised only a minor part of the whole cell population.It is likely,therefore,the expression of GFAP in astrocytes may vary under different conditions and the reactive astrocytes have some different properties from their ordinary situation.
【Key words】 Cell culture;Glia cell;Injury
CNS损伤后胶质细胞的反应虽然已进行了大量的研究［1］，但其详细的细胞及分子机制仍不清楚，由于在体研究对实验结果的解释上存在困难，使得对这一问题的体外研究受到重视，为此人们建立了多种离体的中枢损伤胶质细胞反应模型。其中的Yu［2］胶质细胞刮损模型因其重复性好，操作简单而被广泛采用。本实验应用刮损模型对脊髓混合性胶质细胞机械损伤后的各种细胞的形态学变化进行了动态观察和免疫细胞化学研究。
材料和方法
1.细胞培养
采用本实验室改良的Ransom［3］方法。24孔塑料培养板每孔以鼠尾胶涂布后吹干，孕14～15d昆明种小鼠脱颈处死后，无菌条件下取出双侧子宫置冰盒上，解剖显微镜下剥离胎鼠脊髓，置D1-SGH(D1为无钙镁离子的Puck液，SGH为蔗糖和HEPES缓冲液)液中，仔细剥去血膜，吸去D1液后，剪碎脊髓，加入0.125%胰酶消化液，在37℃消化20min，吸去消化液，加入含20%胎牛血清的DMEM培养液，室温停留10min,DMEM培养液洗1次，用火焰抛光的吸管在含20%胎牛血清的DMEM培养液中将消化后的组织块吹打成细胞悬液，用血球计数板计数后，将细胞悬液用含20%胎牛血清的DMEM培养液接种于铺有鼠尾胶的培养孔(5.0×105/cm2)，37℃，5%CO2孵箱孵育，3d后换以含10%胎牛血清的DMEM培养液，以后每隔3d换液，培养液为含10%胎牛血清的DMEM培养液。
2.损伤及观察
培养4周后，用塑料滴头将已平铺成层的胶质细胞作纵横划痕，连续48h相差显微镜观察损伤区域边缘胶质细胞的动态变化并摄片。
3.免疫细胞化学染色
吸去培养液，0.01mol/L PBS洗1次，培养孔内加4%多聚甲醛，4℃固定1h，PBS洗3次，每次5min,常规ABC法染胶质原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP 1∶5 000)，半乳糖脑苷脂(galaclocerebroside,GC 1∶200)，纤维细胞抗原抗体(Thy1.1 1∶100)，神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE 1∶200)，染色结果摄片保存，每次实验重复3次。同时以相应一抗动物的正常血清代替一抗作为对照，实验中所用抗体间预先经测试未发现有免疫交叉反应。
结 果
培养的胚胎期(E14～15)小鼠脊髓细胞在含10%胎牛血清的DMEM培液内生长4周后，在相差显微镜下观察可见细胞分为两层：上层为散在分布的折光性强的小细胞，多呈圆形，部分略呈多角形，有纤细突起沿胞体呈放射状分布，突起可有复杂分支，据其形态可判断为少突胶质细胞。下层为扁平折光差的大细胞，胞核明显，相互排列紧密，铺满整个培养孔，相互界限不清，是星形胶质细胞。
经过划痕后，划痕区形成约500μm宽的空白裸区，边缘清晰整齐，在星形胶质细胞下面可见有疏松排列的细胞(图1)，相差观察损伤边缘的细胞，可发现随时间推移，边缘细胞可发生一系列动态变化：损伤后4h，即有细胞从损伤边缘缓慢移入划痕裸区内，随后进入裸区的细胞逐渐增多，这些细胞可向不同方向伸出并回缩长短不一的突起，突起伸出及回缩速度很快(图2～4)，并可发生细胞分裂(图5～7)。进入裸区的细胞形态大小不一，形成的突起可以长达10倍于胞体直径，突起上可有折光性很强的膨体样结构，并可沿突起向其末端移动，同一突起上不同的膨体结构可相互间发生融合。不同细胞的突起长度及膨体数目及移动速度会有不同，但一般均在突起末端有一膨体。胞上一页 [1] [2] [3] 下一页
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