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人鼻咽不同部位粘膜上皮PCNA表达的比较研究 |
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rdquo;疾病，只有具有分裂能力的干细胞才能发生肿瘤性转变；另一方面，致癌因子的致癌效应只有通过细胞分裂才能固定下来，因而发生活跃细胞增殖的部位也是对致癌因子最敏感的部位。所以，鼻咽部顶壁和侧壁粘膜上皮易发鼻咽癌的倾向性有可能是该处上皮细胞群体增殖活性相对较高的反映。基于这一推测，我们应用单克隆抗体免疫组织化学方法对鼻咽不同部位粘膜上皮增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)的表达状况进行了较为系统的比较研究，得到了有意义的结果，现报道如下。
材料和方法
1.组织来源及其处理
7例正常成人鼻咽标本取自突发性死亡病例，年龄25～50周岁，男女性别比为4∶3。15例胚胎鼻咽标本取自因故引产胚胎［顶臀长(crown-rump length,CRL)＞100mm］，胚胎性别不拘。鼻咽标本沿纵向分割为顶、后、左侧、右侧、底壁5个区域，每1个区域又被横切分割为3等分，在10%中性缓冲福尔马林中固定12h，作定向石蜡包埋。切片(5μm)附贴于经3-aminopropyltriethoxysilane(APES)处理的玻片上，空气干燥过夜。
2. 抗体
PCNA免疫组织化学用鼠抗人PCNA单克隆抗体PC-10(IgG2a,DAKO)进行，该抗体可直接应用于甲醛固定的石蜡包埋标本。
3. 免疫组织化学
切片经常规脱蜡、复水至蒸馏水，以3%H2O2溶液于室温处理5min以灭活内源性的过氧化物酶。蒸馏水洗后用标记链菌素-抗生物素系统(labelled streptavidin biotin,LSAB；DAKO公司产品)进行免疫染色。试验了各种不同稀释度一抗(PC-10)的反应效果，发现以1∶1 000稀释在4℃孵育过夜的效果最佳。Ni-DAB-H2O2为显色系统，核固红衬染。PCNA阳性核呈紫蓝至紫黑色。用TBS代替PC-10作阴性对照。
4.图像分析
在石蜡切片标本上用PC-10进行的免疫染色通常呈颗粒状，小部分呈弥散状，几乎完全局限于增殖细胞群体的核内，核着色深浅不一。本研究将所有核染色都看作阳性反应，而不管其染色反应的特征。用真彩色通用医学图像处理分析系统(TIPAS-98)对免疫染色结果进行图像处理和分析。在高倍镜(×400)下对每张切片各随机抽取10个视野，测量上皮区域内PCNA阳性细胞核所占的百分比。对每个鼻咽标本每个壁的3个横切等分段各取3张间隔50μm的连续切片进行分析，这样每个壁共计分析9张切片即90个视野，计算出每个鼻咽标本各个区域粘膜上皮的PCNA阳性细胞平均百分数(即PCNA标记指数)，以此来衡量鼻咽不同部位粘膜上皮的PCNA表达水平。用万道软件《统计设计与分析系统(SDAS)》对结果进行数据处理和统计分析。
结 果
1.PCNA阳性细胞在鼻咽上皮中的整体分布特点
我们仔细研究了PCNA阳性细胞(以下简称为PCNA细胞)在人鼻咽上皮中的整体分布状态，发现其与胚胎发育进程密切相关。在CRL为105～162mm胚胎的鼻咽上皮中，高达87%的PCNA细胞分布于基底细胞层；在CRL长为175～234mm胚胎的鼻咽上皮中，PCNA细胞的分布没有明显的上皮层次差异；而在CRL长为253～347mm胚胎的鼻咽上皮中，有90%的PCNA细胞分布于下2/3到1/3的上皮层区域内，其基底细胞层的PCNA细胞较前两个时期有所下降，但仍比成年人鼻咽上皮中基底细胞区域内的PCNA细胞要多得多。在发生上皮类型转化的区域内，PCNA细胞主要分布于基底细胞层，而且其基底细胞层中PCNA细胞的比例(约80%)明显高于同一胚胎鼻咽的非转化上皮区的基底细胞层(约40%)。成人鼻咽上皮的PCNA细胞有92%分布于下1/5到1/6的上皮层中，其基底细胞层的PCNA细胞很少见，通常不到10%(图1～8)。
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