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胚胎不同器官的细胞连接蛋白基因表达研究 |
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； Gene; Expression; Embryo
通过缝隙连接蛋白(connexin,Cx)分离及其基因克隆，现已发现连接蛋白基因(connexin genes)是一个有10多个成员的超基因家族［1］。
缝隙连接在胚胎发育早期就存在，它们对胚胎细胞分化、形态发生及生长调控起重要作用［2］；在成体组织和体外培养的细胞，它们与细胞分化密切相关［3］。Cx基因的表达状态决定了细胞缝隙连接通道的形式、连接通讯通道的形态结构和数量、也决定了通讯通道消亡。Cx基因的表达对细胞诱导、分化、增殖、细胞程序性死亡及衰老等生物过程有着十分密切的关系。
胚胎早期，神经系统和循环系统尚未建立或未发育完善，长距离信息传递难以进行。要使胚胎细胞向各种组织器官分化，离不开细胞间化学信息的交换。在个体发育12～16h的桑葚胚期即可见缝隙连接形成，但它随胚胎发育而经常发生动态变化。鸡胚发育20～36h，外胚层细胞间有密集的细胞缝隙连接，至48h，缝隙连接逐渐减少，而桥粒变得明显［4］。Warner等［5］将细胞连接蛋白抗体注入非洲爪蟾8细胞期早期胚胎，以阻断通讯通道；结果注射过抗体的卵裂球的发育出现明显的区域性形态缺陷现象：脑和眼发育不良或完全缺失，这些缺陷可能是直接阻断了控制局部分化的信息传递而造成的。从而提供了第一个关于缝隙连接在早期胚胎发育中起重要作用的直接证据，表明连接蛋白基因表达可能是细胞生长调控和器官发育过程中某些分化事件的关键性候选基因。
为了探索胚胎发育过程中不同器官不同分化阶段的细胞连接蛋白基因的表达规律及其与细胞分化的关系，本研究采用Cx基因系列作为分子探针，通过Northern印迹法，对不同时期胚胎肝、肾、肺和胃的Cx基因表达状态进行了研究。
材料和方法
1. 材料
收集胚胎标本28例；其中5周、6周各5例，3～5个月各6例，母体健康；取胚胎肝、胃、肺、肾等组织块置于液氮中贮存。胎龄按月经龄减2周计算。
2. DNA探针的制备
2.1 质粒DNA的抽提：分别将8种携带pCx质粒及内对照pGAPDH质粒的细菌小量复苏后，划琼脂平皿，37℃过夜培养。次日挑取单个克隆进行小量扩增，采用碱裂解法快速提取质粒，用相应的内切酶消化鉴定。鉴定确认后的克隆进行大量扩增和抽提质粒DNA［6］，质粒资料见表1。(所用质粒均由本校肿瘤研究所李桂源教授从美国带回，惠赠)。
表1 所用质粒资料一览表
Table 1 A list of plasmids containing Cx cDNA
质 粒
plasmids 载 体
vectors 限制性内切酶
restriction enzymes 插入片断(kb)
inserts(kb) 种 属
species
质粒Cx26(pCx26) pSG5 BamHⅠ 0.68
人(human)
质粒Cx31.1(pCx31.1) SP63T Bg1 Ⅱ 0.85 小鼠(mouse)
质粒Cx32(pCx32) pGEM3 EcoR Ⅰ 1.5 大鼠(rat)
质粒Cx33(pCx33) SP64T Bg1 Ⅱ 0.9 大鼠(rat)
质粒Cx37(pCx37) SP64T Hind Ⅲ/XbaⅠ 1.25 小鼠(mouse)
质粒Cx40(pCx40) pGEM4z EcoR Ⅰ/XbaⅠ 1.1 小鼠(mouse)
质粒Cx43(pCx43) pSG5 BamHⅠ 1.11 人(human)
质粒Cx46(pCx46) BSK+ EcoR Ⅰ 1.6 人(human)
内对照质粒(pGAPDH) / EcoR Ⅰ/Hind Ⅲ 0.6 人(human)
2.2 质粒DNA内切酶消化和片断回收：以1μg DNA与2～3IU内切酶的比例，37℃，60～90min消化质粒，然后在1%的琼脂糖凝胶上电泳分离。于紫外灯下观察，并切下插入目的片断的DNA，用低熔点琼脂糖法和Glass MAX(GIBOL-BRL公司)试剂盒回收、纯化。测OD值确定浓度，4℃贮存备用。
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