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AGE受体介导 2M |
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皮肤成纤维细胞系(GM05757A)购自NIGMS human gentic mutant cell repository(USA)。细胞在37℃、体积分数5%CO2条件下，培养于含10%胎牛血清(FCS)的Dulbecco s modified eagle medium中。第7～12代细胞用于实验。
二、体外制备AGE－β2M［7］：
将纯化的人β2M(Cortex Biochem,USA)在含D－葡萄糖的磷酸缓冲液中孵育30 d。以同样条件、但不含葡萄糖的孵育液中培养的β2M作为对照。制备的样品均经透析，并经抗AGE抗体(South Carolina 大学 John Boynes教授惠赠)ELISA和荧光分光光度法鉴定。AGE－β2M样品中，AGE含量(荧光分光光度法)为26.4 U/mg 蛋白，对照为0.6 U/mg蛋白。所有样品均经E－toxate试剂盒(Sigma,USA)测定内毒素含量，均＜0.2 μg/L。
三、AGE－β2M结合分析：
按文献的方法［4］标记AGE－β2M。标记特异活性为2.5×104 counts.min－1.ng－1。将HSFs与不同浓度［125I］－AGE－β2M在有或无25倍摩尔过量的未标记AGE－β2M的PBS中培养3 h。在另一组实验中，HSFs与不同浓度兔抗人RAGE IgG(Columbia大学Schmidt博士惠赠)或非免疫兔IgG(Sigma,USA)在4℃下预培养2 h，洗涤后加入［125I］－AGE－β2M。反应结束时用4℃PBS洗涤。用含肝素的缓冲液洗脱结合于细胞上的放射物质。以总结合活性减去非特异结合活性(加入过量未标记蛋白孔的结合活性)作为特异结合活性。数据用Klotz和Hunston法分析。
四、成纤维细胞增殖试验：
DNA合成分析按文献的方法采用［3H］－TdR法［8］。HSFs在含0.2%乳清蛋白的DMEM(DMEM－LH）中培养24 h，再与含各种浓度AGE－β2M或β2M的DMEM－LH培养66 h，加入［3H］－TdR，6 h后洗涤细胞，加入0.1 mol/L NaOH／0.1%SDS，用液闪仪测定β计数。
直接密度计数法按文献的方法［9］。HSFs在10%FCS－DMEM中隔夜培养。洗涤后加入含50 mg/L AGE－β2M或β2M的DMEM－LH，在37℃下培养72 h后计数细胞。结果以对照(单纯培养基培养的细胞计数)的百分数表示。
五、抗RAGE和抗EGF抗体对HSFs增殖反应的影响：
将生长至融合期或隔夜培养的HSFs与含不同浓度兔抗人RAGE IgG或非免疫兔IgG的DMEM－LH在37℃下预培养2 h。洗涤后加入50 mg/L的AGE－β2M培养72 h。用［3H］－TdR或直接密度计数法测定增殖反应。为确定抗EGF抗体对HSFs增殖反应的影响，在HSFs培养中同时加入50 mg/L的AGE－β2M和羊抗人EGF中和抗体(R&D System,USA)。再按上述方法测定HSFs的增殖。
六、数据处理：
实验均重复3次。数据以±s表示。变量分析采用ANOVA。成对数据的比较采用Student－Newman－Keuls法。
结果
一、AGE－β2M通过RAGE介导的作用与HSFs结合：
125I－AGE－β2M与HSFs共同孵育后，呈现剂量依赖的特异性结合。kd≈86.5±9.5 mol/L(n＝3）。非特异结合率均≤总结合率的25%。HSFs与抗RAGE IgG预孵育后，与125I－AGE－β2M的结合呈现剂量依赖的抑制现象，而与非免疫兔IgG预孵育对125I－AGE－β2M的结合无明显影响(图1)。
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