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型胶原与氧化性低密度脂蛋白相互作用的机制研究 |
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箱购自德国Heraeus公司，电泳仪为瑞典LKB公司产品，自动γ计数仪购自中科院上海原子能研究所日环仪器厂。
二、方法：
(一)脂蛋白的分离和氧化：序列超速离心法分离人血清LDL(d=1.019～1063 g/L)脂蛋白浓度用Lowry法测定，LDL经滤菌后贮于4℃备用［8］，所有的LDL经电泳鉴定均为一条带。按McFarlane单氯化碘法制备125Ⅰ-LDL，比放活性为80～300 counts.min－1/ng－1蛋白，游离碘率不超过2%。LDL氧化修饰系Cu2+介导法［8］，LDL与4种不同终浓度的Cu2+作用后，获得4种修饰程度不同的ox-LDL(表1)。ox-LDL的相对电泳迁移率(relative electrophoretic mobility, REM)经琼脂糖凝胶电泳检测，以ox-LDL与LDL实际迁移距离之比来表示［8］；而ox-LDL的聚集程度则以OD680nm的吸光值表示［9］。
(二)多聚氨基酸的修饰：将多聚精、酪、组、赖氨酸分别溶于pH为3.5、10.0、6.0和8.0磷酸盐缓冲液PBS中，待其完全溶解后，分别用丙二醛(malondialdehyde, MDA)和HNE修饰。反应中4种多聚氨基酸终浓度为2.0 g/L，MDA终浓度为45 mmol/L，而HNE的终浓度为5 mmol/L，置37℃孵育5 h后，于相应pH的PBS中透析，24 h后取出，贮于4℃冰箱内备用［6］。
(三)胶原凝胶的制备：从大鼠尾腱中提取Ⅰ型胶原，即将鼠尾腱用0.1%的醋酸溶液浸泡48 h后，经离心获得上清液，即Ⅰ型胶原，经Van-Gieson染色呈特征性绿色荧光，其蛋白含量用Lowry法检测。在冰浴中将胶原溶液(终浓度1.0 g/L)、DMEM、三蒸水快速混合并应用0.17 mol/L的NaOH调pH至7.0，DMEM终浓度为细胞培养用液的1/10。迅速将所得溶液1 mL移至35 mm直径的培养皿内，置37℃、体积分数为5%CO2、95%空气、100%湿度条件下孵育，直至完全成胶。上述操作均在无菌条件下进行［10］。
(四)［125Ⅰ］-LDL与胶原凝胶结合值的测定：分别于胶原凝胶中加入含［125I］标记的天然或氧化修饰LDL的DMEM液1 mL，置于二氧化碳培养箱中孵育，待48 h后取出(其余见图2)，刮除凝胶，放入内有新华1号滤纸的漏斗上，用50 mL PBS分多次冲洗，将洗过的胶原凝胶转移至含有3 mL的1 mol/L NaOH的试管中，待其完全溶解后，分别取部分测定放射性和蛋白含量，［125I］-LDL胶原的结合值以mg脂蛋白/g胶原蛋白表示［10］。
三、统计学处理：
数据以均数±标准差(±s)表示，数据处理采用student t检验、方差分析和秩和检验。
结果
一、［125I］-LDL与胶原凝胶的结合特性：
为去除非特异性吸附于胶原凝胶上的LDL，在测定胶原结合量前对凝胶进行了冲洗 ，结果发现，若用50 mL PBS分10次冲洗，如图1所示，在第一个5 mL冲洗液中，洗出的未结合［125I］-LDL量较大，而到第8～10个5 mL冲洗液时，所含［125I］-LDL已极其微少，仅为第一个5 mL冲洗液的1.23%～1.44%，因此在本研究中选用50 mL PBS来冲洗胶原凝胶。
Fig 1 Amount of ［125I］-LDL in the washing solution of collagen gel
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